Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Очищение капилляров мозга свиньи
- Соберите 8-10 мозгов 5-6-месячных домашних свиней (например, с ближайшей скотобойни) и перевезите их на льду в лабораторию. Мы рекомендуем начинать следующую процедуру очистки в течение 2-3 часов после уничтожения животного.
- Поместите мозги на стерильную скамейку и аккуратно промойте их 1 л PBS в стакане, помещенном на лед.
- Осторожно удаляйте мозговые оболочки из одного мозга за раз с помощью щипцов с тонким наконечником и переносите мозги без мозговых оболочек в другой стакан объемом 1 л с PBS, помещенный на лед. Увеличение затраченного времени может усложнить удаление. Примерное время, используемое для каждого мозга, должно составлять 10-15 минут.
- С помощью скальпеля соскребите серое вещество с одного мозга за раз и перенесите изолированный материал в чашки Петри (8,8 см2), содержащие 20 мл питательной смеси DMEM F-12 (DMEM/F-12), помещенные на лед. Изолируйте как можно больше серого вещества, не удаляя белое вещество. Для первоначальной фрагментации пропустите материал серого вещества через шприц объемом 50 мл без иглы. Продолжайте работу над всеми мозгами и соберите собранный материал серого вещества. Увеличение затраченного времени может усложнить удаление. Примерное время, используемое для каждого мозга, должно составлять 10-15 минут.
- Перенесите выделенный материал серого вещества в трубку измельчителя ручного гомогенизатора тканей в соотношении 50/50 с помощью среды DMEM/F-12. Гомогенизируйте материал, сделав 8 движений вверх и вниз свободным пестом, а затем 8 движений вверх и вниз тугим пестом. Продолжайте до тех пор, пока весь изолированный материал не будет гомогенизирован, затем перелейте гомогенат во флакон объемом 500 мл и разбавьте с помощью DMEM/F-12 до общего объема примерно 450 мл.
- Отфильтруйте гомогенат с помощью флакона объемом 500 мл с синей крышкой и фильтрующим сеткой 140 мкм, и изолируйте капилляры, пропустив ткань через фильтр. Используйте один фильтр на 50 мл гомогената и после этого промойте каждый фильтр DMEM/F-12.
- Поместите капилляросодержащие фильтры в чашки Петри с раствором для разложения трипсина/ЭДТА (2,5 % трипсина, 0,1 нМ ЭДТА в PBS), коллагеназы CLS2 (2000 Ед/мл) и ДНКазы 1 (3400 Ед/мл) в DMEM/F-12. Используйте 1 чашку Петри (8,8 см2, 20 мл раствора) на 3 фильтрующие сетки.
- Поместите чашки Петри при температуре 37 °C на 1 час на орбитальный шейкер со скоростью 180 об/мин или осторожно помешивайте их каждые 10 минут. Через 1 ч смыть капилляры с фильтров с суспензией из чашки Петри с помощью пипетки объемом 1 мл.
- Разделите суспензию из 3 чашек на 2 пробирки по 50 мл и остановите переваривание, добавив по 10 мл DMEM/F-12 в каждую 50-мл пробирки.
- Центрифугируйте клеточные суспензии при 250 x g, 4 °C в течение 5 мин. Отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 10 мл DMEM/F-12. Добавьте еще 20 мл DMEM/F12 в каждую пробирку. Повторите этот шаг центрифуги дважды.
- Дайте пробиркам остыть на льду в течение 5 минут и переложите растворы в 2 новые пробирки объемом 50 мл.
- Центрифугируйте клеточные суспензии при температуре 250 x g, 4 °C в течение 5 минут и повторно суспендируйте каждую гранулу в 8-10 мл (примерно 1 мл/мозг) замораживающего раствора, состоящего из 10% ДМСО в FBS.
- Перенесите клеточную суспензию в криовиальные камеры, используя 1 мл на каждую криовиальную камеру. В среднем, результатом очистки является 1 флакон на каждый используемый мозг, что в среднем обеспечивает эндотелиальные клетки для 12-16 вставок. Поместите флаконы в морозильную камеру при температуре -80 °C не менее чем на 4 часа или на ночь. После этого храните криовалиал в криотанке с жидким азотом.
осторожность: Жидкий азот имеет экстремально низкие температуры. Пожалуйста, наденьте соответствующую защиту.