Способ выделения нейроваскулярных единиц из головного мозга крысы

Аннотация

Источник: Brzica, H., et al,. Простой и воспроизводимый метод подготовки мембранных образцов из свежевыделенных микрососудов мозга крысы. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует процесс выделения микрососудов мозга у усыпленных крыс. Он включает в себя вскрытие мозга, очистку тканей и механическое разложение с последующим повторным центрифугированием для выделения чистой фракции микрососудов.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB. Процедурный поток для протокола показан на рисунке 1.

1. Настройка процедуры

1. Подготовьте буфер микрососудов головного мозга (BMB). Начните с взвешивания 54,66 г D-маннитола, 1,90 г EGTA (этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты) и 1,46 г 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (т.е. Триса) основания в чистом стакане. Добавьте 1,0 л деионизированной воды. Смешайте компоненты буфера BMB с помощью магнитной мешалки. После того, как раствор будет тщательно перемешан, отрегулируйте pH до 7,4, используя 1,0 М HCl.
2. Приготовьте 26% раствор декстрана (МВт 75 000) (w/v) перед обезболиванием животных. Для приготовления раствора декстрана выполните следующие действия.
   заметка: Критически важно приготовить этот раствор заранее, потому что декстрана может раствориться в водном буфере примерно за 1,5-2 часа.
   1. Измельчите измельченный в порошок декстран (26 г на 100 мл буфера) в чистую мензурку.
   2. Отмерьте подходящий объем BMB и раздайте его в отдельную чистую мензурку.
   3. Медленно влейте BMB в стакан с порошкообразным декстраном. Во время заливки BMB вручную перемешайте порошкообразный декстран с помощью стеклянной палочки для перемешивания.
   4. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1,0 М HCl непосредственно перед использованием.
      заметка: Для типичной изоляции микрососудов головного мозга у 12 особей крыс Спрэга-Доули (самцов или самок; в возрасте 3 месяцев; по 200-250 г каждому) требуется 200 мл раствора декстрана (т.е. 52 г декстрана на 200 мл BMB).

2. Извлечение мозговой ткани у крыс Спрэг-Доули

1. После желаемого экспериментального лечения крыс с помощью кетамина (50 мг/кг; 2,5 мл/кг в/) и ксилазина (10 мг/мл; 2,5 мл/кг в/). Разведите кетамин и ксилазин в 0,9% физиологическом растворе до конечных концентраций 20 мг/мл и 4,0 мг/мл соответственно. Усыпляйте животных путем обезглавливания с помощью заточенной гильотины в соответствии с рекомендациями IACUC (Комитет по уходу и использованию институциональных животных). Используйте одну и ту же процедуру как для самцов, так и для самок крыс Спрэг-Доули.
2. Рассекайте кожу с черепа крысы, сделав один поперечный разрез с помощью хирургических ножниц.
3. С помощью ронжера аккуратно снимите пластину черепа и обнажите мозг.
4. Удалите мозг с помощью шпателя. Отделите головной мозг и поместите изолированную мозговую ткань в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 5 мл BMB. Добавьте 1,0 мкл коктейля ингибиторов протеазы на 1,0 мл буфера BMB непосредственно перед использованием.

3. Обработка данных мозгом

1. Перенесите мозговую ткань из конической трубки объемом 50 мл в чистую чашку Петри.
2. С помощью щипцов аккуратно раскатайте мозг по фильтровальной бумаге диаметром 12,5 см, чтобы удалить наружные мозговые оболочки, которые неплотно прилегают к коре головного мозга. Аккуратно прижмите ткань мозга к фильтровальной бумаге и снова сверните ткань. Часто переворачивайте фильтровальную бумагу во время этого шага.
3. Отделите сосудистое сплетение от полушарий головного мозга с помощью щипцов.
   заметка: Сосудистое сплетение представляет собой четкую пленчатую ткань, локализованную на поверхности желудочков головного мозга.
4. Аккуратно разгладьте ткани мозга и удалите оставшиеся мозговые оболочки и обонятельные луковицы с помощью щипцов.
5. Поместите кортикальную ткань мозга в охлажденную стеклянную ступку. Добавьте в раствор 5,0 мл BMB, содержащего коктейль ингибиторов протеазы.
6. Используя верхний силовой гомогенизатор, гомогенизируйте ткани мозга с помощью 15 движений вверх и вниз со скоростью 3700 об/мин. Выполните гомогенизацию с помощью ступки объемом 10 мл и измельчителя для тканей. Между гомогенизацией каждого отдельного образца очистите пестик с использованием 70% этанола.<бр/> заметка: Удары гомогенизации должны быть последовательными по темпу и величине.
7. Разлейте гомогенат в пробирки с маркировкой.

4. Этапы центрифугирования

1. Добавьте 8,0 мл 26% раствора декстрана в каждую меченую центрифужную пробирку, содержащую гомогенат мозга.
2. Дважды переверните трубку, а затем тщательно переверните образец. Проведите вихревую обработку каждого образца под разными углами, чтобы обеспечить тщательное смешивание раствора гомогената мозга с 26% раствором декстрана.
3. Центрифуга для отбора проб при давлении 5 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
   заметка: Для некоторых анализов полезно сравнить микрососуды головного мозга с паренхимой мозга. Если требуется оценка экспрессии белка в паренхиме головного мозга, надосадочная жидкость, полученная на этой стадии центрифугирования (т.е. паренхиматозная фракция мозга), может быть собрана и сохранена при температуре -80 °C для использования в будущем.
4. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора и стеклянной пипетки Пастера.
   заметка: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не потревожить гранулы. В противном случае количество собранных микрососудов головного мозга будет уменьшено, что значительно снизит выход белка из этой процедуры.
5. Ресуспендируйте гранулу в 5,0 мл коктейля ингибиторов протеазы, содержащего BMB (т.е. 1,0 мкл коктейля ингибиторов протеазы на 1,0 мл буфера BMB). Перемешайте гранулу вихрем, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
6. Добавьте 8,0 мл 26% декстрана в каждую центрифужную пробирку и вихрь, как описано в шагах 4.1-4.2 настоящего протокола.
7. Центрифугируйте образцы при давлении 5 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
8. С помощью вакуумной колбы и стеклянной пипетки аспирируйте надосадочную жидкость и следите за тем, чтобы гранула, содержащая микрососуд мозга, не была нарушена.
   заметка: Излишки материала, прилипшие к стенке трубки, не содержат микрососудов и должны быть тщательно очищены и удалены.
9. Повторите шаги с 4.5 по 4.8 еще два раза.
10. После завершения 4 этапов центрифугирования декстрана добавьте 5,0 мл BMB в каждую гранулу и вихрь для повторного взвешивания образца.
    заметка: После выполнения шага 4.10 можно собрать целые микрососуды для анализа локализации белка. Этого можно достичь, взяв аликвоту объемом 50 мкл повторно суспендированной гранулы микрососуда и намазав ее на предметное стекло микроскопа. Затем микрососуды закрепляют при температуре 95 °C на нагревательном блоке в течение 10 минут, после чего фиксируют в ледяном этаноле еще на 10 минут. Затем предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока они не потребуются для визуализирующих исследований.

Результаты

Рисунок 1: Описание процедур и протоколов по выделению микрососудов головного мозга крысы и подготовке образцов мембраны

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коктейль ингибиторов протеазы	Сигма-Олдрич	#P8340	Компонент буфера микрососудов головного мозга
Д-маннит	Сигма-Олдрич	#M4125	Компонент буфера микрососудов головного мозга
ЭГТА	Сигма-Олдрич	#E3889	Компонент буфера микрососудов головного мозга
База Тризма	Сигма-Олдрич	#T1503	Компонент буфера микрососудов головного мозга
Декстран (75 000 МВт)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Декстран, используемый на этапах центрифугирования для отделения микрососудов от паренхимы мозга
Зетамин	MWI Здоровье животных	#501072	Общая анестезия
Ксилазин	Западное медицинское снабжение	#5530	Общая анестезия
0,9% солевой раствор	Западное медицинское снабжение	Н/Д	Общий обезболивающий разбавитель
Фильтровальная бумага (диаметр 12,5 см)	ВВР	#28320-100	Используется для удаления мозговых оболочек из тканей головного мозга
Центрифужные пробирки	Сарштедт	#60.540.386	Одноразовые пробирки, используемые для этапов центрифугирования декстрана
Пирс™ Кумасси Плюс (Брэдфорд) Проба	ThermoFisher Scientific	#23236	Измерение концентрации белка в мембранных препаратах
Верхний силовой гомогенизатор Wheaton	DWK Медико-биологические науки	#903475	Требуется для гомогенизации образцов
10,0 мл стеклянной ступки и измельчителя салфеток для пестика	DWK Медико-биологические науки	#358039	Требуется для гомогенизации образцов
соляная кислота	Сигма-Олдрич	#H1758	Требуется для регулировки pH буферных растворов
Стандартные щипцы	Инструменты для точной науки	#91100-12	Используется для рассечения тканей головного мозга
Фридман-Пирсон Ронгер	Инструменты для точной науки	#16020-14	Используется для вскрытия черепа с целью изоляции мозга
Конические центрифужные пробирки 50 мл	ThermoFisher Scientific	#352070	Используется для забора мозговой ткани после изоляции
Стеклянные пастеровские пипетки	ThermoFisher Scientific	#13-678-20С	Используется для аспирации клеточного мусора после спинов декстрана
Этанол безводный	Сигма-Олдрич	#459836	Используется для очистки салфеток шлифовальной машины; разбавляется до 70% дистиллированной водой
кетамин
Ведро для льда