Методическая статья

Генерация корковых пирамидальных нейронов из нервных стволовых клеток человека

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Gouder, L., et al,. Трехмерное количественное определение дендритных шипиков из пирамидальных нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео описывается метод приготовления стеклянных покровных стекол, покрытых полиорнитином и ламинином, для усиления адгезии и роста нейральных стволовых клеток. Метод включает в себя последовательные инкубации и промывки, способствуя формированию поддерживающей матрицы, которая способствует росту и дифференцировке нейронных клеток, имитируя структуры, обнаруженные в нейронах.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Культура нейронов
    заметка: Перепрограммирование фибробластов в плюрипотентных стволовых клетках, приверженность линии дорсального конечного мозга, производение, амплификация и банкирование поздних корковых предшественников (LCP) были описаны в работе Boissart et al. Нейрональная дифференцировка LCP-подобных клеток также проводилась по Boissart et al. с небольшими модификациями. Разработаны и другие методики прямого перепрограммирования фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с последующей их дифференцировкой в нейроны. Этот протокол был сохранен, поскольку он позволяет селективно производить пирамидальные глутаматергические нейроны.
    1. Обработать 6-луночные культуральные планшеты стеклянными покровными стеклами поли-орнитином (разбавленным до 1/6 в DPBS (фосфатно-солевой буфер Dulbecco), исходная концентрация 0,01%) O/N, с последующим проведением трех промывок в DPBS. Затем добавьте ламинин (исходная концентрация 1 мг/мл, разведенный в 500 раз в DPBS) в течение не менее 10 часов под проточный колпак.
    2. Планшет и отправка NSC с низкой плотностью (50 000 клеток/см2) в 6-луночных культуральных планшетах со стеклянными покровными стеклами в 3 мл питательной среды, состоящей из DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Eagle's Medium)/F12 (500 мл), 2 флаконов (по 5 мл) добавки N2, 2 флаконов (по 10 мл) добавки B27, 10 мл пен-стрептомицина (пенициллин = 10 000 ед/мл и стрептомицин = 10 000 ед/мл), 1 мл 2-меркаптоэтанола (Стоковый раствор: 50 мМ) и ламинина (1/500), без факторов роста. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Выполняйте этот шаг осторожно, добавляя клетки медленными вращательными движениями, чтобы уменьшить кластеризацию клеток.
    3. Удалите питательную среду. Добавьте свежую среду N2B27, содержащую 2 мкг/мл свежего раствора ламинина, чтобы сохранить нейрон прикрепленным к стеклянной покровной стеколе и избежать комков. Меняйте среду каждые 3 дня. Оставьте немного оставшейся среды (200 μл) перед добавлением свежей среды, чтобы предотвратить высыхание клетки. В качестве альтернативы действуйте быстро и измените общий объем (3 мл).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PD-PBS (1X), без кальция, магния и фенола красногоGibco/ Life Technologies14190169
Биореагент в растворе поли-L-орнитинаСигма ОлдричП4957
Мышиный ламининДатчер Доминик354232
Доплата N2Gibco/ Life Technologies17502048
B-27 Добавка без витамина А (50X)Gibco/ Life Technologies12587010
ДМЭМ/ГАЙКА. МИКС F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Нейробазальная медицина SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-меркаптоэтанолGibco/ Life Technologies31350-010 (Английский)
Пен-СтептомицинGibco/ Life Technologies15140-122
Покровное стекло 13 ммВВРНомер 631-0150
Реагент для пролонгации золота против выцветания avec DAPIGibco/ Life TechnologiesП36931
Tween(R) 20 Bioextra, вязкая жидкостьСигма Олдрич ЧимиП7949
Фибробласты человекаБиорепозиторий клеточной линии КориеллаGM 4603 и GM 1869Институт медицинских исследований Кориелла, Камден, штат Нью-Джерси, США
CO2-инкубатор
6 луночных планшетов для культивирования
Пиптетта

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи