Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка и удаление мозга у мыши для нарезки
- Подготовьте к перфузии и нарежьте инкубацией.
- Примерно за 30 минут до нарезки приготовьте раствор для резки с высоким содержанием сахарозы и искусственную спинномозговую жидкость (aCSF) с низким содержанием кальция для инкубации среза перед записью или визуализацией.
- Разложите все необходимые инструменты (большие тупые ножницы, маленькие пружинные ножницы, анатомические щипцы, большие ножницы или гильотину, ножницы для радужной оболочки, ювелирные щипцы, шприц 10 мл с иглой 27G x 1/2 дюйма, небольшой кусок фильтровальной бумаги размером 1 см x 2 см и пипетку Пастера со сломанным наконечником для переноса среза) для перфузии и нарезки, и подготавливаем перфузионный лоток.
- Установите инкубационную камеру с кислородосодержащим aCSF на водяной бане при температуре 32 °C и чашку для культивирования, заполненную раствором для резки.
- Подготовьте этап резки к нарезке.
- Отрежьте небольшой кусочек 3% агара примерно 1 см3 для использования в качестве упора для мозга и 1,5 см x 1,5 мм x 3 мм для бугорка, который будет использоваться для поддержки нижнего холмика (IC).
- Приклейте ограничитель к сцене с помощью цианоакрилатного клея, а также выступ с правой стороны ограничителя так, чтобы они образовывали угол 80°.
- Удалите мозг.
- Глубоко обезболить мышь с 12-го дня после рождения на 20-й день (p12-p20, в идеале p14-18) кетамином в дозе 100 мг/кг и ксиласином в дозе 3 мг/кг (или по аналогичной процедуре, одобренной комитетом по этике).
заметка: Подтвердите надлежащий уровень анестезии по отсутствию реакции на защемление пальца ноги. Поскольку животное находится под наркозом непродолжительное время, офтальмологическая мазь не нужна.
- С помощью ножниц с тупым концом обнажите грудную клетку от мечевидного отростка к шее.
- Найдите мечевидный отросток, и сделайте горизонтальный надрез примерно 1,5 см.
- Сделайте два вертикальных разреза от концов предыдущего горизонтального среза до плеч, примерно по 1,5 см каждый.
- Разрежьте диафрагму и реберные соединения, чтобы обнажить сердце.
- Маленькими пружинными ножницами сделайте небольшой, 2-5 мм разрез в правом предсердии, от вентральной до тыльной стороны сердца.
- Используя шприц объемом 10 мл с иглой 27G x 1/2 дюйма, введите левый желудочек и быстро проведите конфузию животного режущим раствором с высоким содержанием сахарозы.
- Как только кровь станет прозрачной, удалите голову ножницами большего размера.
заметка: Мы не проводили систематической оценки полезности перфузии. Однако, по нашему опыту, транскардиальная перфузия у мышей в таком молодом возрасте может быть выполнена почти со 100% успехом и имеет преимущество в устранении красных кровяных телец, которые могут флуоресцировать и мешать визуализации.
- Разрежьте кожу по средней линии, чтобы обнажить череп.
- С помощью согнутых ножниц радужной оболочки разрежьте череп между глазами, затем, начиная с разреза между глазами, осторожно разрежьте спереди назад вдоль средней линии шва, стараясь не повредить мозг под ним.
заметка: Твердая мозговая оболочка обычно отделяется вместе с черепом. При необходимости удалите твердую мозговую оболочку перед аккуратным удалением мозга.
- С помощью ювелирных щипцов вскрывают череп и осторожно извлекают мозг, после чего помещают мозг в раствор для резки. Будьте осторожны, чтобы не повредить кору головного мозга.
2. Подготовка мозга к нарезке
- Подготовка мозга к монтажу на вибратомную сцену.
- С помощью предметного стекла, отмеченного двумя линиями под углом 90° и диагональной линией с углом 17° от верхнего левого угла до нижнего правого угла, пересекая места пересечения двух линий, поместите мозг тыльной стороной вверх, используя лезвие бритвы, удалите 2-4 мм рострального конца мозга, создав плоскую поверхность.
- Поместите каудальную сторону мозга вверх на вновь созданную плоскую поверхность и совместите дорсальную поверхность мозга с горизонтальной, а среднюю линию мозга — с вертикальной линией.
- Совместите лезвие бритвы с линией 17°, наклоните бритву под углом 30° и удалите примерно 3 мм правой коры головного мозга в двойном диагональном разрезе (17° от горизонтальной плоскости и 60° от корональной).
- Монтаж мозга на вибратомной сцене.
- Положите небольшой лист фильтровальной бумаги 1 см х 2 см на вентральную сторону мозга так, чтобы длинное измерение было перпендикулярно средней линии.
- Осторожно нанесите небольшое количество цианоакрилатного клея на область перед ограничителем оборота (и слева от неровности).
- Положите двойную диагонально разрезанную поверхность мозга на клей так, чтобы каудальная часть мозга и задний мозг были опирались на бугорок, а правая сторона мозга была прижата к упору.
- Деликатно надавите на мозг, следя за тем, чтобы вся поверхность соприкасалась с камерой для нарезки.
3. Получение колликуло-таламокортикального среза
- Быстро возьмите режущую ступень и поместите в вибратом, заполните сцену режущим раствором.
- Выровняйте лезвие с верхней (вентральной стороной) мозга.
- Удалите 1-1,5 мм от верхней части мозга, удалите срезы 300-500 мкм и оцените глубину после удаления><.
Примечание: Когда видны IC, медиальное коленчатое тело (MGB) и латеральное коленчатое ядро (LGN), а зубчатая извилина образует форму буквы «С», возьмите от одного до двух срезов по 600 мкм. Смотрите рисунок 1А.
- Поместите ломтики в нагретую (32 °C) камеру выдержки.
