Методическая статья

Индукция нервно-мышечных соединений in vitro из сконструированных плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных человеком

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник:Lin, C. et al., In vitro Нервно-мышечное соединение, индуцированное человеческими индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками. J. Vis. Exp.(2020).

В этом эксперименте подробно описан метод создания нервно-мышечных соединений из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Он использует поэтапный процесс дифференцировки для содействия развитию миотрубок и моторных нейронов, а также образованию синапсов, что приводит к функциональным нервно-мышечным соединениям.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение пластин, покрытых внеклеточным матриксом (ECM)

  1. Разбавить ECM (см. Таблицу материалов) ледяным 1x PBS до конечной концентрации 2%
  2. Добавьте 1 мл ЭКМ к 49 мл 1x PBS в пластиковой пробирке объемом 50 мл. Хорошо перемешайте, несколько раз перемешав пипеткой вверх и вниз.
  3. Поместите по 1 покровному стеклу в каждую лунку 6-луночной пластины. Добавьте по 1,5 мл 2% ECM в каждую лунку.
  4. Инкубируйте луночный планшет с 2% ECM в течение 2 ч при 37 °C.
  5. Отсадите ECM из луночной пластины и храните пластину при температуре 4 °C перед использованием.

2. Дифференциация iPSC в сторону NMJ

  1. Засейте 4 x 105 иПСК в лунку на 6-луночном планшете, подготовленном в разделе 1. Обязательно засейте клетки на покровном листе, предварительно помещенном в лунку.
    заметка: В данном исследовании использовалась клеточная линия iPS 201B7MYOD.
    1. Удалите среду из ИПСК на чашке для культуры 6 см и промойте ИПСК один раз 1x PBS.
    2. Добавьте в чашку 1 мл раствора для отслоения клеток и инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C.
    3. Добавьте в чашку 3 мл клеточной среды эмбрионального ствола (ES) примата и аккуратно пипетируйте 3 раза.
    4. Соберите надосадочную жидкость, содержащую отделенные иПСК, в пластиковую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 160 x g при 4 °C в течение 5 минут.
    5. Осторожно отасканируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте иПСК в 3 мл клеточной среды ES приматов с 10 мкМ Y27632 и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
    6. Разбавляют иПСК клеточной средой приматов ES и 10 мкМ Y27632 до концентрации 2 x 105 клеток/мл. Добавьте 2 мл iPSC на покровный листок, предварительно нанесенный в лунку, описанную в разделе 1.

3. Индукция iPSCs в NMJ

  1. В 1-й день, через 24 ч после посева ИПСК в 6-луночный планшет, удалите питательную среду и замените ее 2 мл свежей среды для клеток приматов, содержащей 1 мкг/мл доксициклина, на каждую лунку.
  2. В каждую лунку поменяйте среду с 2 мл миогенной дифференцировочной среды (МДМ) (табл. 1), содержащей 1 мкг/мл доксициклина (конечная концентрация). Обновляйте среду каждый день со 2 по 10 день.
  3. С 11-го дня переключайте среду на 2 мл NMJ среды (табл. 1) в каждую лунку. После этого обновляйте носитель каждые 3\u20124 дня до 30-го дня.
  4. Наблюдайте за дифференцированным NMJ с помощью фазовой инвертированной микроскопии на 30-е сутки. NMJ может быть использован для следующего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Таблица 1: Формула среды.

Среда миогенной дифференцировки (МДМ)MEM-альфа500 мл
100 мМ 2-МЭ1117μЛ
Доксициклин1μг/мл
КСР56 мл (конечная до 10%)
Ручка/с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среда, факторы роста и реагенты
2-меркаптоэтанолНакалай тескеNo 21418-42
B27, GibcoGibco12587-001
БДНФСистемы НИОКР248-BD
Раствор для отслойки клеток, AccumaxТехнологии стволовых клеток#07921
Сушилка для критических точекХитачиЕС-2030
ДоксициклинТакара631311
ВКМ, Матригель (сниженный фактор роста)КорнингNo 356230 (Английский
ГДНФСистемы НИОКР212-GD
Гелеобразование, гель IPСотрудники GenoПГ20-1
Установка для нанесения покрытий на ионыДЖЕОЛJEC3000FC
Среда iPSC, mTeSRТехнологии стволовых клеток85850
Нокаут SR (KSR)Gibco10828-028 (Английский)
Микроскопия живых клетокКомпания NikonМикроскоп Eclipse Ti
MEM-альфаGibco12571-071
N2, GibcoGibco17502-048
Нейробазальная средаGibcoNo 21103-049
НТ3Системы НИОКР267-Н3
Клеточная среда ES приматовРепроСеллRCHEMD001
СЭМХитачиС-4700
ТЭМХитачиН7650
У27632Вако Кемикалс ГмбХ253-00513 (Английский
) )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MYODROCK

Похожие статьи