Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Экспериментальная установка
- Прежде чем начать забор тканей и клеток, убедитесь, что все инструменты стерильны. При необходимости автоклавируйте острые хирургические ножницы, пару очень тонких щипцов и пару тонких стандартных щипцов. Кроме того, при необходимости, стерилизуйте каждый субстрат перед посевом клеток с использованием УФ-стерилизации, воздействия этанола или стерилизации паром.
- Приготовление сред и стоковых растворов для забора и диссоциации нейронов
- Приготовьте среду Bottenstein and Sato's (BS), добавив 1% пенициллин-стрептомицин (PS) и 1% добавку N2 в среду Ham's F12. Рассчитайте конечный необходимый объем в 500 мкл на лунку (при использовании планшета на 24 лунки).
- Приготовьте запасы коллагеназы для внутривенного введения в среде Ham's F12 в концентрации 1,25% мас./об. Отфильтруйте и стерилизуйте раствор и храните при -20 °C в виде аликвот 200 мкл.
- Запасы трипсина поджелудочной железы крупного рогатого скота готовят в среде Ham's F12 в концентрации 2,5% мас./об., стерилизуют и хранят при -20 °С в виде аликвот 200 мкл.
- Приготовьте стоковый раствор фактора роста нервов (NGF) в концентрации 5 мкг/мл в стерилизованном фильтром растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) объемом 1 мг/мл без жирных кислот в среде F12 и храните при -20 °C в виде 200 мкл аликвот. Не фильтруйте NGF после восстановления.
- В случае, если модификация поверхности не проводилась, покройте покровные стекла/пластины поли-D-лизином (0,1 мг/мл в течение 15 мин при комнатной температуре [RT]) и/или ламинином (2-10 мкг/см2 в течение 2 ч при 37 °C) для поддержки прикрепления нейронов и роста нейритов, в зависимости от обстоятельств.
- Перед использованием всегда нагревайте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
2. Забор и диссоциация нейронов ганглиев дорсальных корешков (DRG)
- Убейте крысу путем вывиха шейного отдела и обезглавливания. Побрейте крысу и подтяните кожу, чтобы обнажить позвоночник. С помощью острых ножниц иссекайте позвоночный столб, уделяя особое внимание ограниченным органам и кровеносным сосудам. Перенесите позвоночный столб в шкаф биологической безопасности (класс II) с помощью чашки Петри и удалите всю дорсальную часть.
- Разделите позвоночный столб пополам по продольной оси с помощью стерильных и острых хирургических ножниц, чтобы обнажить ткани спинного мозга. На этом этапе полезно разрезать позвоночный столб на два меньших сегмента ниже уровня грудной клетки, чтобы облегчить работу с ним во время забора нейронов DRG. С помощью тонких щипцов аккуратно удалите всю ткань пуповины, стараясь не вытянуть и не удалить корни DRG. Таким образом, DRG и корни будут обнажены в позвоночных каналах, все еще заключенные в колонну. Наблюдайте за DRG как за белыми нитями, выходящими прямо из каналов.
- Вытащите весь корень DRG (а не только DRG) из позвоночных каналов с помощью очень тонких щипцов, углубляясь в позвоночные каналы и уделяя особое внимание тому, чтобы не повредить корни ганглиев Переложите DRG в небольшую чашку Петри (60мм2), содержащую 3-4 мл среды Ham's F12 с добавлением 1% PS. Если вы используете разных животных, используйте отдельную посуду.
- Под рассекающим микроскопом очистите DRG от избытка нервных корешков, окружающих ганглии, с помощью стерильных щипцов и скальпеля для уменьшения загрязнения глиальных клеток. Переложите DRG в небольшую чашку Петри (35 мм2) с 1,8 мл свежей среды F12.
- Добавьте 200 μл 1,25% мас./v раствора коллагеназы IV типа (конечная концентрация 0,125%) и инкубируйте DRG при 37 °C, 5% CO2 в течение 1 ч. Осторожно отсасывайте среду стеклянной пипеткой, следя за тем, чтобы не аспирировать и не повредить DRG. Добавьте свежую среду F12 с добавлением 0,125% масс./об. фермента коллагеназы IV типа и инкубируйте в течение 1 часа, как описано выше.
- Отсадите среду и аккуратно промойте DRG средой F12. Затем добавьте 1,8 мл среды F12 и 200 μл трипсина (конечная концентрация 0,25% мас./об.) и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 30 минут.
- Удалите трипсин и добавьте 1 мл среды F12 с добавлением 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS) для остановки ферментативной реакции. Отсадите средство и аккуратно промойте DRG средством F12 в течение трех раз, чтобы удалить следы сыворотки.
- Добавьте 2 мл свежей среды F12 и осторожно перенесите DRG со средой в пробирку объемом 15 мл с помощью стеклянной пипетки. Аккуратно диссоциируйте нейроны DRG, пипетируя вверх и вниз (около 8-10 раз) стеклянной пипеткой (в качестве альтернативы можно использовать пластиковые наконечники).
- Дайте грануле осесть на дне пробирки и соберите среду в новую пробирку. Добавьте 2 мл свежей среды F12 в пробирку с гранулой и повторите механическую диссоциацию стеклянной пипеткой. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока суспензия не станет однородной (примерно в 3-4 раза) и соберите все диссоциированные ДРГ в новую трубку. Этот метод снижает напряжение, возникающее в результате механической диссоциации, и улучшает жизнеспособность нейронов.
- Отфильтруйте полученную гомогенизированную суспензию в новую пробирку объемом 15 мл с помощью клеточного фильтра 100 мкм для удаления недиссоциированных нейронов и другого мусора. На этом этапе может быть удобно сначала отфильтровать клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл, а затем перенести раствор в меньшую пробирку с помощью стеклянной пипетки. Центрифугируйте суспензию при 110 г в течение 5 мин.
- Приготовьте 15% BSA, добавив 500 мкл 30% раствора BSA к 500 мкл среды F12. Медленно впрыскивайте раствор вниз по стенке пробирки объемом 15 мл, чтобы создать постепенный белковый след. На этом этапе полезно удерживать трубку под углом 45° и медленно отпускать BSA, используя цифры на трубке falcon в качестве ориентира для формирующейся «дорожки».
- Аспирируйте надосадочную жидкость с этапа 2.10, оставляя 500 мкл на дне пробирки, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в той же среде. Медленно пипетируйте суспензию по белковому следу, заранее подготовленному на шаге 2.11 (используйте цифры на пробирке в качестве ориентира) и центрифугируйте при 500 г в течение 5 минут.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл модифицированной среды BS.<бр/>
заметка: Объем для ресуспензии нейронов DRG может быть увеличен до фактического необходимого объема, в зависимости от желаемой конечной концентрации клеток и количества образцов, которые должны быть засеменены. Одно животное обеспечит достаточное количество клеток для эксперимента с 24-луночным планшетом.
- Инкубируйте высеянные образцы при 37 °C, 5%CO2 в течение 2 ч для присоединения клеток и, наконец, добавьте свежую среду BS с добавлением 50 нг/мл NGF.
