1. Поддержание стволовых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол поддержания клеток, описанный ниже, применяется к плюрипотентным стволовым клеткам (ПСК), содержащимся в адгезивном монослое. Среды, другие реагенты и планшеты для клеточных культур, используемые перед обработкой диметилсульфоксидом (ДМСО), могут быть скорректированы по мере необходимости. Для всех следующих протоколов в данной рукописи клетки должны обрабатываться в шкафу биологической безопасности.
- Покрыть стерильными, 6 лунками, обработанные тканевой культурой планшеты с плюрипотентной матрицей или субстратом, квалифицированным стволовыми клетками, приготовленным в соответствии с инструкциями производителя, и инкубировать не менее 1 ч в инкубаторе с содержанием CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Пластины с покрытием можно обернуть пленкой и хранить при температуре 4 °C до одной недели.
- Разморозьте криоконсервированные ПСК на водяной бане при температуре 37 °C. Стерилизуйте флакон этанолом перед помещением в бокс биологической безопасности, затем немедленно перенесите клетки путем пипетирования в стерильную коническую пробирку, содержащую 5-10 объемов предварительно подогретых сред стволовых клеток.
- Центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Аспирируйте среду и мягко ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды стволовых клеток с добавлением ингибитора 10 мкМ rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK), такого как Y-27632.
- Аспирируйте культуральную матрицу из планшета и засейте клетки с желаемой плотностью, обычно 0,5-1 x 106 клеток на лунку, по меньшей мере 2 мл среды стволовых клеток на лунку.
заметка: Плотность покрытия может варьироваться в зависимости от клеточных линий и клонов и должна быть соответствующим образом оптимизирована.
- Поддерживайте клетки, ежедневно заменяя их предварительно подогретыми средами стволовых клеток. Разделяйте клетки примерно на 70-80% конфлюенции или когда клеточные колонии начинают контактировать.
- Для расщепления клеток аспирируйте среду и промойте клетки стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS). Инкубируйте клетки с 1 мл раствора диссоциативного фермента на лунку в течение 5-10 минут при 37 °С.
- Промойте и ресуспендируйте клетки предварительно подогретыми средами стволовых клеток и переложите в стерильную коническую пробирку с 5-10 объемами среды стволовых клеток. Выполните шаги 1.3-1.7 для заполнения ячеек.
2. Предварительная обработка ДМСО
ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке клеток для предварительной обработки ДМСО перед дифференцировкой, плотность исходных клеток должна быть оптимизирована с учетом типичной скорости роста линии стволовых клеток, а также используемого протокола дифференцировки. При необходимости подтвердите плюрипотентность с помощью обычных маркеров. Клетки должны быть пассированы по крайней мере 1-2 раза после первоначального размораживания до дифференцировки.
- 2D-дифференциация культур
- Когда клетки достигнут соответствующего слияния, подготовьте пластины с покрытием, диссоциируйте клетки и приготовьте одноклеточную суспензию, как описано выше.
- Подсчитайте живые клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, включая трипановый синий или другой маркер жизнеспособности.
- Поместите клетки на 6-луночный планшет с покрытием в соотношении 0,5-1 x 106 клеток на лунку в среде стволовых клеток с 10 μМ ингибитором ROCK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеточных линий, протестированных в нашей лаборатории, эти плотности обычно приводили к 80%-90% сливающихся клеток в течение 24-часовой предварительной обработки ДМСО.
- Дайте клеткам инкубироваться в течение 24 ч при 37 °C в инкубаторе сCO2 (5%CO2, влажная атмосфера).
- Приготовьте 1%-2% ДМСО в предварительно подогретой среде стволовых клеток (например, 100 мкл ДМСО в 10 мл среды = 1% раствор ДМСО или 200 мкл ДМСО в 10 мл среды = 2% раствор ДМСО).
- После 24-часовой инкубации аспирируйте среду из клеток и замените ее раствором ДМСО.
- Перед дифференцировкой дайте клеткам инкубироваться в течение от 24 до 48 ч при 37 °C в инкубаторе сCO2 (5%CO2, влажная атмосфера).
Примечание: Как правило, 24-часовая обработка ДМСО достаточна для большинства человеческих эмбриональных и индуцированных линий плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК и ИПСК). Клеточные линии с очень медленными темпами роста (длительное время удвоения) могут извлечь пользу из 48-часовой инкубации с ДМСО. Для 48-часовой инкубации с ДМСО среду можно заменить свежей средой стволовых клеток с 1%-2% ДМСО после первых 24 часов обработки.
3. Дифференциация на первичные зародышевые слои
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже описаны методы, ранее доказавшие свою эффективность в нашей лаборатории для ПСК, выращенных в монослое на 6-луночных планшетах. Любой протокол дифференцировки по выбору должен быть использован после лечения ДМСО для стимулирования дифференцировки в желаемые линии. Удалите раствор ДМСО после 24-48 ч лечения и продолжайте дифференцировку в соответствии со стандартными протоколами.
- Дифференциация эктодермы
- Предварительно обработайте клетки ДМСО, как описано выше для 2D-культур.
- Приготовьте Ноггин и SB431542 исходные растворы.
- Приготовьте эктодермальную дифференцировочную базовую среду путем растворения нокаутирующей сыворотки (KOSR) до конечной концентрации 10% в нокаутирующей модифицированной среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
заметка: Подготовьте достаточное количество базовой среды для 3-4 дней смены среды.
- Готовят эктодермальные дифференцировочные среды, добавляя Noggin до конечной концентрации 500 нг/мл и SB431542 до конечной концентрации 10 мкМ к соответствующему объему предварительно подогретого KOSR/нокаутного DMEM.
- После предварительной обработки ДМСО аспирируйте среду из клеток и замените ее дифференцировочной средой (например, 2 мл на лунку 6-луночного планшета).
- Дайте клеткам инкубироваться в течение 3-4 дней при 37 °C в инкубаторе сCO2 (5%CO2, влажная атмосфера), ежедневно заменяя среду свежедобавленными факторами дифференцировки.