$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Приготовление буферов для рассечения и питательных сред
- Для выделения спинного мозга крысы приготовьте 100 мл диссекционного буфера (1x PBS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллин-стрептомицина) и поставьте в холодильник.
- Приготовьте 100 мл бессывороточной среды (SFM) и нагрейте до 37 °C. Для приготовления SFM добавьте 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина, 2% B27 и 10% гормональной смеси в среду Neurobasal-A. Для приготовления гормональной смеси приготовьте среду 1:1 DMEM/F12, содержащую 0,6% глюкозы, 3 мМ NaHCO3, 5 мМ HEPES, 25 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл апотрансферрина, 10 мкМ путресцина, 30 нМ селена и 20 нМ прогестерона.
- Приготовьте гальваническую среду, обогащенную фактором роста EFH (к SFM добавьте 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл bFGF и 2 мкг/мл гепарина) и нагрейте при 37 °C.
2. Забор и препарирование перивентрикулярной ткани спинного мозга взрослой крысы
- Предварительно простерилизуйте инструменты для препарирования в этаноле и промойте в стерильном физрастворе или автоклавных инструментах. Дайте крысам (в возрасте от 6 до 8 недель) смертельную инъекцию пентобарбитала натрия (1 мл в дозе 65 мг/мл) или передозировку анестетика (т.е. 4% изофлурана) в соответствии с утвержденным в учреждении протоколом для животных. Обмакните спину крысы в 70% этанол и удалите кожу на спинной поверхности большими ножницами для препарирования.
- Держа ножницы перпендикулярно тыльной поверхности, поперечно разрежьте позвоночный столб над задними конечностями. Используйте ножницы меньшего размера, чтобы продольно разрезать тыльную мышцу, лежащую над позвоночным столбом, в ростральном направлении, чтобы обнажить остистые отростки.
- Начиная с обнаженного каудального конца, введите ронжеры или небольшой тупой инструмент для резки костей экстрадурально в латеральную поверхность позвоночного канала в пространстве между спинным мозгом и позвоночным столбом. Сделайте небольшие надрезы на пластинке (костные дуги слева и справа от остистых отростков с каждой стороны позвонков) и осторожно снимите пластинку, чтобы обнажить спинной мозг (рисунок 1A-D). Убедитесь, что угол наклона лезвий неглубокий и параллельен спинному мозгу, чтобы не повредить основной спинной мозг.
- Продолжайте ламинэктомию в ростральном направлении, чтобы обнажить грудной и шейный отделы спинного мозга.
- Аккуратно иссеките спинной мозг от позвоночного столба тупыми тканевыми щипцами и с помощью микроножниц осторожно отрежьте корни, чтобы освободить спинной мозг. Поместите иссеченный спинной мозг в чашку Петри, содержащую стерильный буфер для диссекции крыс при температуре 4 °C (описан выше в 1.1). Промойте ткань в свежеприготовленном рассекающем буфере при температуре 4 °C и разрежьте ножницами спинной мозг поперечно на сегменты по 1 см (рисунок 1E).
- Для каждого сегмента ткани используйте одну руку, чтобы удерживать ткань тонкими щипцами. С другой стороны, с помощью микроножниц осторожно удалите вышележащие мозговые оболочки, белое вещество и большую часть серого вещества с помощью препарирующего эндоскопа. В качестве альтернативы используйте тонкие щипцы (Dumont #4), чтобы удалить большую часть серого и белого вещества, оставив только перивентрикулярную область спинного мозга, которая включает эпендиму и небольшое количество окружающего серого вещества (рисунок 1F-H).
- Соберите рассеченную перивентрикулярную ткань в 10-сантиметровую стерильную чашку Петри, содержащую буфер для диссекции холодных крыс.
3. Выделение и культивирование NSPC спинного мозга взрослых крыс
- Выполните следующие действия асептически в вытяжке с ламинарным потоком.
- Рассеченную перивентрикулярную ткань крысы измельчить на кусочки по 1 мм с помощью микроножниц.
- Ферментативно диссоциировать фарш протеолитическими ферментами с помощью набора для диссоциации папаина, как указано в таблице материалов/реактивов.
заметка: Компоненты реагента включают в себя четыре флакона: Флакон 1: Сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS). Флакон 2: Папаин, содержащий L-цистеин и ЭДТА. Флакон 3: Дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза). Флакон 4: Ингибитор овомукоидной протеазы с бычьим сывороточным альбумином (БСА).
ПРИМЕЧАНИЕ: Папаин представляет собой сульфгидрильпротеазу с широкой специфичностью для белковых субстратов. Папаин в настоящем описании получен из латекса растения папайи Carica и разлагает большинство белковых субстратов более интенсивно, чем протеазы поджелудочной железы. В процессе диссоциации происходит некоторое повреждение клеток, в результате чего ДНК высвобождается в диссоциативную среду, что увеличивает вязкость и затрудняет пипетирование. Таким образом, ДНКаза включается в процедуру выделения клеток для расщепления ДНК без повреждения интактных клеток. Овомукоиды представляют собой ингибиторы гликопротеиновых протеаназ, используемые для ингибирования активности папаина после стадии диссоциации.
- При первом использовании смесь ингибиторов овомукоидов альбумина (флакон 4) восстановите с 32 мл EBSS (флакон 1), а затем храните при температуре 4 °C и используйте для последующих выделений. заметка: В результате получается раствор в эффективной концентрации 10 мг ингибитора овомукоидов и 10 мг альбумина на мл.
- Добавьте 5 мл EBSS (флакон 1) во флакон с папаином (флакон 2), получая раствор из расчета 20 ЕД папаина/мл в 1 мМ L-цистеина с 0,5 мМ ЭДТА. Убедитесь, что раствор папаина выглядит прозрачным после полного растворения. В противном случае поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C на десять минут, пока папаин полностью не растворится, чтобы обеспечить общую активность фермента.
- Добавьте 500 μл EBSS (флакон 1) во флакон с ДНКазой (флакон 3) и аккуратно перемешайте, так как ДНКаза чувствительна к денатурации сдвигом. Добавьте 250 мкл раствора ДНКазы во флакон с папаином, в результате чего конечная концентрация составит примерно 20 ЕД/мл папаина и 0,005% ДНКазы. Сохраните оставшуюся ДНКазу для использования в дальнейшем.
- Поместите измельченную крысиную ткань в раствор папаина.
- Инкубировать при 37 °C при постоянном перемешивании на качалке для диссоциации ткани в активированном растворе папаина. Инкубируйте ткани крысы в течение от 45 минут до 1 часа.
- Измельчите смесь с помощью пипетки объемом 10 мл, чтобы диссоциировать оставшиеся кусочки ткани и получить мутную клеточную суспензию. Перенесите клеточную суспензию (не включайте кусочки недиссоциированной ткани) в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
- Ресуспендируйте гранулированные клетки в среду, содержащую овомукоид, ингибитор папаина.
- Приготовьте овомукоидный раствор, смешав 2,7 мл EBSS (флакон 1) с 300 мкл восстановленного раствора альбумин-овомукоидного ингибитора (флакон 4) в конической пробирке объемом 15 мл. Добавьте 150 μл раствора ДНКазы (флакон 3).
- Отбросьте надосадочную жидкость из гранулированных клеток и немедленно восстановите клеточную гранулу в разбавленной смеси альбумин-ингибитора ДНКазы.
- Отделение интактных клеток от клеточных мембран путем центрифугирования с помощью одноступенчатого прерывистого градиента плотности.
- Приготовьте прерывистый градиент плотности, добавив 5 мл раствора ингибитора альбумина (флакон 4) в пробирку объемом 15 мл, и с помощью пипетки объемом 5 мл аккуратно и медленно нанесите клеточную суспензию (приготовленную, как описано выше) поверх раствора ингибитора альбумина.
- Центрифуга при 70 x g в течение 6 мин при RT.
заметка: Граница раздела между двумя слоями градиента должна быть хорошо видна, хотя минимальное перемешивание на этой границе не влияет на результат. Фрагменты мембраны остаются на границе раздела и диссоциированные клеточные гранулы на дне пробирки.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл крысиной среды EFH (предварительно подогретой до 37 °C). Подсчитайте плотность живых клеток с помощью гемоцитометра и поместите клетки в колбу для культур T25 с плотностью 10 клеток/мкл в EFH. Типичный выход клеток из ткани крысы составляет примерно 2 x 106 клеток с жизнеспособностью около 80%. Если желательны клональные культуры, затравливайте клетки плотностью менее 10 клеток/мкл. Инкубируйте колбы при 37 °C при 5%CO2 и дайте культурам расти в течение 1 недели, чтобы избежать скопления сфер.
