Выделение и культивирование перицитов головного мозга мышей

Аннотация

Источник: Mehra, A., et al., Метод с высокой производительностью для выделения церебральных перицитов у мыши. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует метод выделения церебральных перицитов из мозга мыши. Выделенные клетки культивируют в перицитоспецифических средах, чтобы способствовать пролиферации перицитов.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Приготовление растворов

1. Приготовьте 500 мл промывочного буфера A (WBA): 10 мл раствора HEPES в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS). Хранить при температуре 4 °C.
2. Приготовьте 500 мл промывочного буфера B (WBB): 0,1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) с 10 mM раствором HEPES в HBSS. Хранить при температуре 4 °C.
3. Приготовьте 300 мл 30% раствора декстрана в WBA, перемешав раствор в течение ночи при комнатной температуре. Перед применением раствор автоклавировать при температуре 110 °C в течение 30 минут. После автоклавирования дайте раствору отдохнуть при комнатной температуре в течение 2-3 часов. Хранить раствор при температуре 4 °C.
4. Приготовьте 100 мл 0,1% раствора БСА в холодном растворе декстрана. Энергично встряхивайте в течение 3-4 минут и храните при температуре 4 °C.
5. Приготовьте полную питательную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), растворив 20% сыворотки теленка, 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 1% витаминов, 2% аминокислот Basal Medium Eagle (BME) в базальных средах DMEM и хранить при температуре 4 °C. Добавьте 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) перед использованием.
6. Приготовьте полноценную перицитарную среду путем добавления добавок для роста перицитов (поставляемых с перицитарной средой) и 20% сыворотки плода теленка (FCS) в базальную среду перицитарной культуры и храните при температуре 4 °C.

2. Восстановление тканей мозга и удаление мозговых оболочек

1. Для консистенции используйте мышей одного возраста и одного пола в каждой партии экстракции. Используйте приют для животных, свободный от патогенов, и обеспечьте свободный доступ к воде. Чтобы обеспечить эффективность и минимальное использование животных, избегайте потерь тканевого материала.
2. Усыпить C57BL/6J, 4-6 недель, самцов мышей (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, Франция).
3. Быстро иссекайте мозговую ткань в стерильных условиях, избегайте любых повреждений тканей. Осторожно поместите ткань в 40 мл холодного фосфатно-солевого буфера (PBS).
4. Перенесите мозговую ткань в холодном PBS в чашку Петри (100 мм х 15 мм).
5. Поместите ткани мозга на стерильную сухую безворсовую салфетку и с помощью щипцов с изогнутым кончиком удалите мозжечок, стриатум и затылочные нервы.
   1. Удалите все видимые мозговые оболочки ватным тампоном. Поместите ткань мозга вверх ногами и раскройте доли ватным тампоном легкими движениями наружу. Удалите все видимые кровеносные сосуды.
   2. Поместите свободную мозговую ткань мозговых оболочек в чашку Петри (100 мм x 15 мм) с 15 мл холодного WBB.

3. Гомогенизация

1. Перенесите ткань в растворную трубку от измельчителя тканей Dounce и добавьте 3-4 мл WBB с помощью щипцов.
2. Пропустите через мясорубку «рыхлым» пестиком 55 раз. Промойте «рассыпной» пестик с помощью WBB. Теперь пропустите через мясорубку «тугим» пестиком 25 раз.
3. Разделите суспензию поровну на две пробирки по 50 мл и добавьте в 1,5 раза больше холодного 30% BSA-декстрана, энергично встряхивая пробирки, чтобы перемешать суспензию.

4. Выделение сосудистой фракции

1. После энергичного встряхивания пробирок центрифугируйте пробирки в течение 25 минут при 3 000 x g и 4 °C.
2. Перенесите надосадочную жидкость (вместе с верхним слоем миелина) в 2 новые пробирки и центрифугируйте пробирки в течение 25 минут при 3 000 x g и 4 °C. Сохраните гранулы после первого центрифугирования, добавив 3 мл холодного WBB (держите гранулу при 4 °C).
3. Повторите шаг 4.2 и тщательно сохраните гранулы после 2-го центрифугирования.
4. Выбросьте декстран и миелин вместе с остатками тканей из пробирок из шага 4.3. Хранить гранулы в холодном ВБВ.
5. Объедините содержимое пробирки 1 и пробирки 2 из шага 4.1 и доведите до конечного объема 10 мл с помощью холодного WBB.
6. Повторите этот шаг для трубок из шага 4.2 и шага 4.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наконец, есть 3 пробирки от 3 центрифугий.
7. Диссоциируйте гранулу 6 движениями вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл до тех пор, пока не останутся видимые комки гранул.
8. Отфильтруйте суспензии ячеек каждой трубки с помощью вакуумного фильтра в сборе и фильтра из нейлоновой сетки.
   заметка: Этот этап фильтрации важен для удаления более длинных/больших сосудов с помощью сетчатого фильтра.
9. Восстановите и восстановите капилляры путем соскабливания фильтра с помощью щипцов с плоским наконечником или скребка в WBB при комнатной температуре. Отфильтруйте суспензию с помощью свежего фильтра, чтобы восстановить больше капилляров
10. Разделите фильтрат поровну на две пробирки и центрифугируйте в течение 7 минут при 1 000 x g и RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе центрифугирования приготовьте ферментативный раствор. Определите необходимый объем ВББ в соответствии с количеством используемых животных (см. Таблицу материалов). Добавьте 1x DNase 1 и 1x Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochlor (TLCK) (см. Таблицу материалов) в WBB и предварительно нагрейте до 37 °C.
11. Соберите гранулы с шага 4.10 в одну пробирку с предварительно подогретым WBB с ферментами. Добавьте предварительно подогретую 1x коллагеназу/диспазу. Поместите трубку в водяную баню для встряхивания стола при температуре 37 °C ровно на 33 минуты.
12. Остановите ферментную реакцию, добавив 30 мл холодного WBB. Центрифугируйте суспензию в течение 7 мин при 1 000 x g и RT.
13. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и диссоциируйте гранулу в WBB 6 движениями вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл. Этот шаг должен быть менее строгим и сравнительно более быстрым.
14. Центрифугировать суспензию в течение 7 мин при 1 000 x g и RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удалите покрытие с посуды для культуры и промойте ее один раз DMEM при комнатной температуре. Посуду для культивирования клеток в течение не менее 1 ч в режиме РТ.
15. Отбраковать надосадочную жидкость из пробирки, полученной на шаге 4.14, и диссоциировать гранулу в новой полной среде DMEM, пластинировать ячейки (Day 0, P0) в 9 лунках по 6 лунок (1 лунка по 9,6 см2 каждая).

5. Пролиферация церебральных перицитов

1. Поддерживайте клеточные культуры при температуре 37 °C и 5%_CO2 в стерильном инкубаторе. Замените питательную среду через 24 ч (день 1) после нанесения покрытия на клетки, тщательно удалив мусор. После 1-го дня меняйте питательную среду каждые 48 часов.
2. Наблюдайте за культивированием клеток не менее 7-8 дней. К этому времени должны быть заметны клеточные наросты на вершине эндотелиального унислоя.
3. Пассаж клеток на 8-10-й день (в зависимости от слияния) в культуральной среде перицитов до пассажа 1 (P1) на покрытых желатином культуральных планшетах. Меняйте питательные среды каждые 2 дня. Наблюдайте за клетками в течение 6-7 дней. Клетки последовательно снова разделяют до пассажа 2 (P2) на 17-й день [и пассажа 3 (P3) на 24-й день только при необходимости], выращивают в перицитарной среде в пластинах, покрытых желатином.
   заметка: Клетки должны быть готовы к экспериментам/наблюдениям при почти 80-90% конфлюенции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аминокислоты BME	сигма	Б-6766	Хранить при температуре 4 °C.
Базальные среды DMEM	Инвитроген	316000083	Хранить при температуре 4 °C.
Основной фактор роста фибробластов	сигма	Ф-0291	Хранить при температуре -20 °C.
БСА	сигма	А-8412	Хранить при температуре 4 °C.
Диспаза коллагеназы	сигма	10269638001	Приготовьте 10-кратный исходный раствор в стерильном PBS-CMF. Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и храните при температуре -20 °C. Примечание: Для этапа ферментного расщепления протокола, на каждую группу из 10 мышей для экстракции, требуется 300 мкл 10-кратного диспаза коллагеназы.
декстран	сигма	No 31398
ДНКаза I	сигма	11284932001	Приготовьте стоковый раствор 1000X, растворив 100 мг в 10 мл стерильной воды, и храните при температуре -20°C.
желатин	сигма	Г-2500	Готовят рабочее покрытие, внося 0,2% раствор желатина в стерильный PBS-CMF (8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 0,2 г/л KH2PO4, 2,86 г/л NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Автоклавируйте раствор не менее 20 минут при температуре 120 °C и храните при комнатной температуре. Питательные посуды должны быть покрыты не менее 4 часов при температуре 4 °C.
Гентамицин	Биохром АГ	А-2712	Хранить при температуре 4 °C.
глутамин	Мерк	И.00289	Хранить при температуре -20 °C.
HBSS	сигма	Н-8264	Хранить при температуре 4 °C.
ХЕПЕС	сигма	Н-0887	Хранить при температуре 4 °C.
Матригель	BD Biocoat	354230 (Английский	Приготовьте рабочий лакокрасочный раствор Матригель путем разведения материала в холодном ДПМ в соотношении 1:48 с конечной концентрацией 85 мкг/см2. Посуду для клеточных культур следует покрывать не менее 1 часа при комнатной температуре.
Перицит Средняя мышь	Научно-исследовательские лаборатории	1231	Хранить при температуре 4 °C.
Тозиллизин хлорметилкетон	сигма	Т-7254	Приготовьте стоковый раствор 1000X в WBA, растворив 16 мг в 10,88 мл WBA, чтобы получить 4 мМ раствор, и храните при 4 °C.
Витамины	сигма	Б-6891	Хранить при температуре -20 °C.
Фильтрационные инструменты	Сефар, Нейлоновая сетка, пористость 60 микрон
Лабораторное оборудование	Роторная центрифуга с поворотным ковшом
Водяная баня с мешалкой
Ламинарный колпак : BSL2
Стеклянная посуда (все компоненты подлежат термической стерилизации)	Шлифовальная машина со стеклянным пестиком
Пестик I: 0,0035 - 0,0065 дюйма
Пестик II: 0,0010 - 0,0030 дюйма
Вакуумный фильтр в сборе с опорным основанием фильтра из фриттованного стекла с крупной пористостью