Получение суспензии одиночных клеток из ткани гиппокампа мыши

Аннотация

Источник: Трухильо, М., и др. Комбинированная механическая и ферментативная диссоциация ткани гиппокампа мозга мыши. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует протокол получения высокожизнеспособной суспензии одиночных клеток из гиппокампа мозга мыши с использованием комбинации автоматической механической диссоциации и смеси ферментов для помощи в ферментативном пищеварении.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Приготовьте смесь ферментов 1 и 2 для каждого образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов более 2 мл используйте серологическую пипетку объемом 10 мл; для объемов 200 мкл-2 мл используйте пипетку на 1000 мкл; для объемов 21-199 мкл используйте пипетку на 200 мкл; для объемов 2-20 мкл используйте пипетку на 20 мкл; для объемов менее 2 мкл используйте пипетку объемом 0-2 мкл.

1. Для каждого образца разморозьте по одной аликвоте фермента Р и фермента А при комнатной температуре.
2. Для смеси ферментов 1 смешайте 50 мкл фермента P и 1900 мкл буфера Z в пробирке с маркировкой C (Таблица материалов).
3. Для смеси ферментов 2 добавьте 20 мкл буфера Y к размороженным 10 мкл аликвоты фермента А.

2. Протокол диссоциации мозга у взрослых

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с образцами, пробирки следует помещать в штатив для пробирок при комнатной температуре, в то время как BSA и D-PBS остаются на льду, если не указано иное.

1. Включите диссоциатор.
2. С помощью щипцов перенесите кусочки ткани гиппокампа в С-образную трубку.
3. Перелейте 30 μL смеси ферментов 2 в С-образную пробирку. Поворачивайте колпачок до тех пор, пока не почувствуется натяжение, затем затяните до щелчка.
4. Поместите С-образную трубку вверх дном в положение диссоциатора; образцу будет присвоен статус «Выбрано» (рисунок 1). Закрепите нагреватель над трубкой C.
5. Нажмите на значок папки, выберите папку «Избранное», прокрутите до и выберите 37C_ABDK_02 программу. Нажмите OK, чтобы применить программу ко всем выбранным C-трубкам, затем нажмите «Пуск» (рис. 1).
6. Наклейте этикетку на одну коническую пробирку объемом 50 мл на образец.
7. Поместите ситечко 70 μм на каждую коническую пробирку объемом 50 мл и смочите 2 мл буфера BSA.
8. По завершении программы снимите нагреватель и трубку C с диссоциатора.
9. Добавьте к образцу 4 мл буфера BSA и нанесите смесь на сетчатое фильтр на коническую пробирку объемом 50 мл.
10. Добавьте 10 мл D-PBS в С-образную трубку, закройте ее и осторожно взболтайте раствор. Нанесите его на клеточное ситечко на коническую пробирку объемом 50 мл.
11. Выбросьте сетчатый фильтр и С-образную трубку. Центрифугируйте суспензию при 300 x g в течение 10 мин при 4°C. Затем аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

3. Удаление мусора

1. Повторно суспендируйте гранулу с 1550 мкл холодного D-PBS и перенесите суспензию в коническую пробирку с маркировкой объемом 15 мл.
2. Добавьте 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и проводите пипеткой вверх и вниз (не делайте вихревыми).
   заметка: Раствор для удаления мусора — это реагент в коммерческом наборе для диссоциации взрослого Брайана.
3. Аккуратно нанесите 1 мл холодной D-PBS поверх клеточной суспензии, прижимая наконечник к стенке конической трубки. Повторяйте до тех пор, пока общее покрытие не составит 2 мл.<бр/> заметка: Этот шаг имеет решающее значение; Выполняйте работу с мастерством и ловкостью.
4. Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин при 4°C с полным ускорением и полным торможением.
   заметка: Если фазы четко не разделены, повторите шаги 7.2-7.3. Центрифугируйте в последний раз при 1000 x g в течение 10 минут при 4°C.
5. Теперь суспензия должна состоять из трех отдельных слоев (рис. 2). Отсасывайте самый верхний слой. Проведите кончиком пипетки вперед и назад, чтобы отсосать белый средний слой. Удалите как можно больше среднего слоя, не нарушая самый нижний слой.
   заметка: Этот шаг имеет решающее значение; Выполняйте работу с мастерством и ловкостью.
6. Добавьте 2 мл холодного D-PBS и перемешайте пипеткой вверх и вниз.
7. Центрифуга при 1000 x g в течение 10 минут при 4°C с полным ускорением и полным торможением. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Суспендировать гранулу в 1 мл буфера BSA.
   Примечание: На этом этапе клетки могут быть ресуспендированы в соответствующем буфере, затем помечены магнитом и изолированы для подготовки к секвенированию одиночных клеток.

Результаты

Рисунок 1: Выбранный статус на шаге 2.4

Рисунок 2: Трехслойная суспензия на шаге 3.5: Буфер (верхний слой), клеточный мусор, раствор для удаления мусора и клетки (нижний слой).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл	Научный центр Фишера	02-682-003 (Английский	Базикс, ассорти цветов
Соколиные пробирки 15 мл	Becton Dickinson Labware Европа	352009	полистирол
25 мл серологических пипеток	Научный центр Фишера	Тел.: 14-955-235
Сетчатый фильтр 70 μм	Научный центр Фишера	Тел.: 08-771-2
Набор для диссоциации мозга у взрослых	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-107-677	Содержит фермент P, буфер Z, буфер Y, фермент A, буфер A, раствор для удаления мусора
БСА	Сигма-Олдрич	А7906-50Г
Falcon 50 мл Конические центрифужные пробирки	Научный центр Фишера	Телефонный номер 14-432-22
Трубки gentleMACS C	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-093-237
Октодиссоциатор gentleMACS с нагревателями	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Стеклянный стакан	Научный центр Фишера	02-555-25А
Наконечники для пипеток GP LTS 20 μL 960A/10	Райнин	30389270
Наконечники для пипеток GP LTS 250 μL 960A/10	Райнин	30389277
Наконечники для пипеток RT LTS 1000 μL FL 768A/8	Райнин	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μл)	Райнин	30386597
Круглое ведро для льда с крышкой	Научный центр Фишера	Тел.: 07-210-129
Трубки с круглым дном и крышкой сетчатого фильтра	сокол	100-0087

)