Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Приготовление одноклеточных суспензий ткани головного и спинного мозга
- Перенесите ткань головного или спинного мозга со средой в верхнюю часть чашки Петри диаметром 100 мм, вылив ткань и среду из трубки. С помощью щипцов переместите ткань на дно чашки Петри. Мелко измельчите головной или спинной мозг стерильным лезвием бритвы. С помощью лезвия бритвы переместите измельченную салфетку на дно пластины, соскребая ткань, чтобы собрать ее.
заметка: Для приведенного ниже протокола ферментативного пищеварения до двух спинных мозгов могут быть объединены вместе для обработки. Мозги должны обрабатываться индивидуально.
- С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте в чашку Петри 3 мл среды RPMI (Roswell Park Memorial Institute (с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS)). С помощью серологической пипетки объемом 10 мл проводите пипетку вверх и вниз, чтобы ресуспендировать ткань в среде, и переносите в коническую пробирку объемом 15 мл.
заметка: Если последующим применением является анализ секвенирования одиночных клеток или объемной РНК или клеточная культура, перед анализом следует протестировать партии FCS, чтобы убедиться в отсутствии активации клеток. В качестве альтернативы клетки могут быть обработаны с использованием 1x PBS с 0,04% BSA вместо RPMI с 10% FCS.
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл промойте чашку Петри еще 2 мл среды, чтобы собрать остатки ткани, и переложите в коническую пробирку для общего объема 5 мл. Держите трубки на льду между этапами обработки.
- С помощью пипетки ресуспендируйте порошок коллагеназы I в среде сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) для получения желаемой концентрации (т. е. 100 мг/мл). Добавьте коллагеназу типа I в коническую пробирку, содержащую образец измельченной ткани, чтобы получить желаемую конечную концентрацию (т.е. 50 мкл для 1 мг/мл).
заметка: Более высокие концентрации коллагеназы увеличивают выход клеток, но могут расщеплять маркеры клеточной поверхности. Таким образом, партии коллагеназы I следует титровать, чтобы определить оптимальную концентрацию, необходимую для получения наибольшего количества жизнеспособных клеток со всеми необходимыми маркерами клеточной поверхности. Например, коллагеназа I была протестирована в конечных концентрациях 0,5 мг/мл, 1 мг/мл и 2 мг/мл на отдельных образцах головного или спинного мозга. Жизнеспособность клеток определяли с помощью метода исключения трипанового синего, а маркеры клеточной поверхности CD45, CD19 и CD4 оценивали методом проточной цитометрии. Концентрация коллагеназы I в 1 мг/мл давала наибольшее количество живых клеток, сохраняя при этом все маркеры клеточной поверхности, представляющие интерес. Таким образом, эта концентрация была использована для дальнейших экспериментов по изучению этих типов клеток.
- Аккуратно суспендируйте порошок ДНКазы I с использованием 0,15 М хлорида натрия до желаемой исходной концентрации. Добавьте ресуспендированную ДНКазу I в коническую пробирку, содержащую образец измельченной ткани, чтобы получить конечную концентрацию 20 Ед/мл.<бр/>
заметка: Партии ДНКазы I варьируются в зависимости от единиц активности на мл. Концентрация, которая должна быть добавлена в образец ткани, будет изменяться в зависимости от единиц активности исходного флакона на миллилитр. Конечная желаемая концентрация на образец составляет 20 Ед/мл.
- Поместите пробирки в штатив для пробирок на водяную баню при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 40 мин. Переворачивайте пробирки каждые 15 мин, чтобы тщательно перемешать ткань с ферментами. После инкубации добавьте 500 мкл 0,1 М ЭДТА (pH = 7,2) в каждую пробирку до конечной концентрации 0,01 М ЭДТА и инкубируйте еще 5 минут для инактивации коллагеназы.
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте 9 мл RPMI с добавлением 10% FCS в каждую пробирку, чтобы довести объем каждой пробирки до ~14,5 мл. Центрифугируйте при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. С помощью пастеровской пипетки с вакуумом аспирируйте надосадочную жидкость, стараясь не касаться клеточной гранулы.
- С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 3 мл 100% исходного изотонического раствора градиента плотности в пробирку, содержащую клеточную гранулу. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте дополнительную среду RPMI 10% FCS, чтобы довести конечный объем до 10 мл, и повторно суспендируйте клеточную гранулу для создания слоя раствора с 30% изотонической плотностью.
заметка: Заранее приготовьте 100% исходную среду изотонического градиента плотности и храните при температуре 4 °C до 3 месяцев. Для приготовления 100% исходного изотонического раствора градиента плотности разбавьте среду градиента плотности (Таблица материалов) буфером для разбавления среды градиента плотности. Приготовьте буфер для разбавления среды с градиентом плотности (80,0 г/л NaCl, 3,0 г/л KCl; 0,73 г/л Na2HPO4, 0,20 г/л KH2PO4; 20,0 г/л глюкозы) и простилизуйте фильтром с помощью вакуумной фильтрующей системы. Приготовьте 100% исходный раствор изотонического градиента плотности, смешав 1 часть буфера для разбавления градиента плотности и 9 частей среды с градиентом плотности. Хорошо перемешайте.
- Хорошо переверните и перемешайте каждую пробирку перед добавлением 70% исходной подложки из изотонического градиента плотности. Вставьте на дно пробирки серологическую пипетку объемом 1 мл, содержащую 1 мл 70% исходного раствора изотонического градиента плотности. Медленно подложите 1 мл раствора, стараясь не образовать пузырьков. Медленно извлекайте серологическую пипетку из пробирки, стараясь не нарушить градиент.
заметка: Для 70% подложки 100% исходный раствор изотонического градиента плотности следует разбавлять до 70% с использованием среды RPMI (т.е. 7 мл 100% исходного изотонического раствора градиента плотности и 3 мл хорошо перемешанных сред RPMI). Кроме того, создание чистой, нетронутой 70% подложки имеет важное значение для удаления миелинового мусора и получения чистых одиночных клеточных суспензий на границе раздела градиента после центрифугирования.
- Центрифуга при 800 x g в течение 30 мин при 4 °C без тормоза. Отсасывайте надосадочную жидкость, включая слой миелинового мусора, пока в пробирке не останется 2–3 мл, стараясь не нарушить клеточный слой. Соберите слой клеток между градиентом плотности 30/70% с помощью пипетки объемом 1 мл и перенесите в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте среду RPMI 10% FCS, чтобы довести конечный объем до 15 мл. Центрифуга 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
заметка: На этом этапе при необходимости можно объединить клеточные слои из двух пробирок. Не объединяйте более двух пробирок, иначе элементы не будут гранулироваться из-за высокой плотности концентрации градиентной среды.
- Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость, чтобы не нарушить клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме/буфере для подсчета клеток с помощью гемоцитометра (например, ресуспендируйте один спинной мозг в 250 мкл буфера FACS для последующего окрашивания поверхности) (Рисунок 1).
- С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите клеточные суспензии в верхнюю часть пробирки с фильтром (Таблица материалов) и дайте клеткам отфильтроваться на дно пробирки, чтобы удалить оставшийся миелиновый мусор.
- Используя трипановый синий краситель, разбавьте его и подсчитайте клетки на гемоцитометре, усреднив не менее двух 16-квадратных сеток для точности40,41.
- Перейдите к желаемому методу анализа одиночных клеток.
заметка: Используя различные формы коллагеназы (т.е. D, тип I, тип II, тип IV), можно эффективно выделить иммунные клетки, микроглию (рис. 1), астроциты, перициты, эндотелиальные клетки49 и нейроны50. Количество клеток с ядрами, полученное для получения результатов, было следующим с использованием титрованного фермента коллагеназы I: Весь мозг, обработанный симуляцией = 500 000–600 000 клеток; Весь мозг TMEV-IDD = 800 000–1 000 000 клеток; Весь спинной мозг с фиктивной обработкой = 150 000–200 000 клеток; Весь спинной мозг TMEV-IDD = 300 000–400 000. Количество клеток будет варьироваться в зависимости от точности сбора, обработки и наличия воспаления ЦНС.
