Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление лампы мягкого света (день 1)
- Используйте прозрачную акриловую доску толщиной 0,3-0,5 см в размере бумаги формата А5. Наклейте белые подушечки на лицевую и заднюю стороны акриловой пластины.
- Установите ряд светодиодных белых огней по краю пластины так, чтобы они могли входить со стороны акриловой пластины, а затем излучать параллельно (Рисунок 1A-F, Рисунок 2B).
заметка: Поскольку диаметры БЭ на ранних стадиях составляют примерно от 200 до 300 мкм, их трудно четко наблюдать невооруженным глазом под люминесцентной лампой чистых скамеек. Напротив, благодаря усилению диффузного отражения, мы можем четко обнаруживать ЭБ с помощью мягкого света, освещенного сбоку (рис. 2B, C). В последующих экспериментах для посевов БЭ рекомендуется использовать 6-луночный планшет. Однако, чтобы лучше показать визуальный эффект мягкого света, в этом кабинете иногда используется посуда для фото- и видеосъемки вместо тарелок, поэтому, пожалуйста, не поймите неправильно. Лампа мягкого света с боковой подсветкой также может использоваться для 6-луночного планшета.
2. Перенос EB и замена среды (дни 2-5)
- Приготовьте новую 6-луночную пластину с низкой адгезией и добавьте в каждую лунку по 2 мл среды для образования эмбриоидных тел (EB).
- Удалите EB вместе со средой с помощью наконечника для дозатора с широким отверстием объемом 1000 мкл (см. Таблицу материалов) и перенесите их на 6-луночный планшет с низкой адгезией (~100 EBs/лунка).
заметка: В процессе работы используется лампа мягкого света (упомянутая в шаге 1), чтобы облегчить наблюдение за БЭ. Отключите другие источники света в помещении, чтобы улучшить визуальный эффект мягкого света.
- Заменяйте на один и тот же объем свежей среды для образования ЭБ каждый день. Используйте вторичный поток, чтобы собрать EB к центру и изменить среду.
- Медленно отсасывайте старую среду с помощью пипетирования к краю лунки. Не сосите слишком сильно; в противном случае EB будут удалены вместе. Затем добавьте свежую среду для ресуспендирования EBs.
заметка: Принцип вторичного потока (рисунок 2D). Вызывайте завихрение потока, вращая тарелку по круговой орбите. Из-за вихревого потока вторичный поток индуцируется и направляется к центру. EB или органоиды сходятся к центру скважины благодаря вторичному потоку, образующемуся при вращении, после чего можно легко выполнить смену среды или перенос эмбриоидов.
3. Нейронная индукция (дни 5-7)
- Приготовьте новый 6-луночный планшет с низкой адгезией и добавьте в каждую лунку по 3 мл нейроиндукционной среды (табл. 1).
- Включите боковой мягкий свет (упомянутый в шаге 1) и выключите другие источники света в помещении.
- Перенесите БЭ в 6-луночный планшет с добавлением нейроиндукционной среды (~100 БЭ/лунка). Добавляйте как можно меньше исходной среды в новую скважину.
заметка: Познакомьте с простыми навыками переноса органоидов. Естественно, под действием силы тяжести и с относительно более высокой плотностью, чем в среде, ресуспендированные EB будут постепенно опускаться при выполнении операции, показанной на рисунке 2E. Таким образом, EB можно удобно передавать. Поскольку, по сравнению с БЭ, свободные клетки и фрагменты мертвых клеток опускаются медленнее, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть удалены с помощью этого метода осаждения (рис. 2F).
- Инкубировать образцы при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч.<бр/>
заметка: Под микроскопом диаметр БЭ составлял примерно 500 мкм, а край был полупрозрачным, что указывало на образование нейроэпителиального слоя.
Таблица 1. Состав нейронной индукционной среды
| Компоненты | том |
| ДМЭМ-Ф12 | 97 мл |
| Доплата N2 | 1 мл |
| Добавка с глутамаксом | 1 мл |
| MEM-NEAA | 1 мл |
| Гепарин | Конечная концентрация 1 мкг/мл |
