1. Питательные среды и подготовка инструментов
- Опрыскайте стол и рабочую зону 70% этанолом и дайте высохнуть.
- Сбрызните инструменты для вскрытия, щипцы и две стеклянные чаши для часов 70% этанолом и дайте им высохнуть на скамейке.
- Изготовьте дополненную среду Шнайдера (SSM, табл. 1) и поместите ее на лед.
- Внесите пипеткой по 1 мл SSM в каждую из стеклянных чашек для часов.
- С помощью микропипетки со стерильным наконечником перенесите только что вылупившихся личинок из тарелки PBS в SSM в первую стеклянную чашку для часов. С помощью микропипетки со стерильным наконечником перенесите только что вылупившихся личинок в ССМ во вторую стеклянную чашку для часов.
2. Вскрытия и посевы мозга
- Как только личинки окажутся во второй стеклянной чашке для часов с SSM, препарируйте мозг личинок с помощью щипцов и препарирующего микроскопа. При необходимости отрегулируйте увеличение.
- Одним щипцом возьмитесь за крюки для рта, а другим осторожно возьмитесь за тело наполовину вниз и потяните в противоположном направлении (Рисунок 1), чтобы разделить личинку на две части.
заметка: Мозг будет расположен прямо за крючками для рта. Обратите внимание, что вокруг мозга могут быть и другие ткани. Будьте очень осторожны при удалении этих тканей, так как это может привести к повреждению мозга.
- После того, как 15-20 мозгов будут препарированы, добавьте 1 мл SSM в одну лунку стерильного лотка для 12-луночных культур. Перенесите только что препарированный мозг в SSM с помощью микропипетки и стерильного наконечника (рисунок 2A).
- Поместите мозги в среду SSM в 12-луночный лоток для культивирования в инкубатор при температуре 25 °C на 24 ч (рис. 2A).
Таблица 1: Рецепт приготовления дополненной среды Шнайдера (SSM). В таблице указан объем всех ингредиентов, необходимых для приготовления 5 мл SSM.
| Ингредиент (начальная концентрация) | Сделать 5 мл | Конечная концентрация |
| Носители дрозофилы Шнайдера | 3,89 мл | |
| Фетальная бычья сыворотка (100%) | 500 μл< | 10% |
| Глютамин (200 мМ) | 500 мкл | 20 мМ |
| Пенициллин (5000 ЕД/мл), стрептомицин (50 000 мкг/мл) | 100 мкл | 1000 Ед/мл Pen, 1 мг/мл стрептококка |
| Инсулин (10 мг/мл) | 10 μл | 0,02 мг/мл |
| глутатион (50 мг/мл) | 5 μл | 0,05 мг/мл |
| В стерильной вытяжке, используя стерильную технику, добавьте все ингредиенты вместе в коническую пробирку объемом 14 мл. Положите его на лед до использования. |
