Выделение первичных олигодендроцитов мышей с помощью иммуномагнитных шариков

Аннотация

Источник: Flores-Obando, R. E. et al., Быстрая и специфическая иммуномагнитная изоляция первичных олигодендроцитов мыши. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод выделения первичных олигодендроцитарных клеток из суспензии нейронных клеток, полученной от детеныша мыши с помощью магнитного разделения. В этом методе используются магнитные шарики, покрытые антителами, специфичными к антигенам олигодендроцитов, что позволяет селективно выделять эти клетки.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Диссоциация коры головного мозга мыши

1. Принесите в жертву постнатальных 5-7-дневных детенышей мышей C57Bl/6N путем быстрой обезглавливания ножницами, предварительно очищенными в 70% этаноле.
   заметка: Для каждого препарата использовали кору головного мозга 5-6 детенышей неонатальных мышей. В среднем, один мозг мыши дает 1-1,5 x 10⁶ первичных олигодендроцитов (Ols).
2. Разрежьте кожу головы по средней линии небольшими ножницами для рассечения и отведите втягивание, чтобы обнажить череп.
3. Осторожно разрежьте череп по средней линии, начиная от отверстия в задней части черепа по направлению к лобной области, поднимая ножницами вверх, чтобы не повредить мозг. Затем, используя отверстие в задней части черепа, разрежьте по направлению к каждой глазнице вдоль основания черепа.
4. С помощью тонких щипцов аккуратно оторвите кору головного мозга от среднего мозга и перенесите их в чашку для культуры тканей толщиной 60 мм, содержащую 7 мл B27NBMA. Повторите шаги с 2.2 по 2.4 для каждого мозга, объединив расчлененные коры головного мозга.
5. Перенесите кору головного мозга в новую 60-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 5 мл диссоциативного буфера (B27NBMA, 20-30 Ед/мл Папаина и 2500 Ед ДНКазы I).
6. Нарежьте кору на мелкие кусочки размером около 1^мм3 с помощью лезвия скальпеля #15 и инкубируйте в течение 20 минут в инкубаторе с температурой 37 °C и 5% углекислым газом (CO₂).
7. Добавьте 1 мл сыворотки для роста крупного рогатого скота (BGS), чтобы остановить ферментативную реакцию.
8. Перенесите кору головного мозга вместе со средой диссоциации в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
9. Осторожно начните диссоциацию мозговой ткани, медленно пипетируя вверх и вниз 6-8 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл, стараясь свести к минимуму образование пузырьков.
10. Дайте кусочкам ткани осесть в течение 2-3 минут и перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку.
11. Добавьте 3 мл B27NBMA, содержащей 10% BGS/2500 U DNase I, в тканевую гранулу.
12. Используйте серологическую пипетку объемом 5 мл для мягкой диссоциации мозговой ткани, одновременно пипетируя вверх и вниз 6-8 раз. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму образование пузырей.
13. Дайте кусочкам ткани осесть в течение 2-3 минут.
14. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Добавьте в тканевую гранулу 3 мл B27NBMA, содержащей 10% BGS/DNase I.
15. Аккуратно диссоциируйте мозговую ткань с помощью наконечника пипетки P1000, одновременно пипетируя смесь среды и мозговой ткани вверх и вниз. Повторяйте шаги 2.13 и 2.14 до тех пор, пока не останутся большие участки ткани или пока не будет исчерпан B27NBMA, содержащий 10% BGS/DNase I, в зависимости от того, что наступит раньше. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму образование пузырей.
16. Суспензия клеток бассейна с предыдущими надосадочными зонтами.
17. Поместите клеточный фильтр 70 μм в пробирку объемом 50 мл. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл аккуратно пропустите объединенную клеточную суспензию через 70-мкм клеточный фильтр.
18. Промойте сетчатый фильтр, добавив 1 мл B27NBMA, содержащей 10% BGS/DNase I.
19. Выбросьте ситечко от ячеек. Доведите объем до 30 мл с помощью B27NBMA, содержащего 10% BGS/DNase I.
20. Перенесите клеточную суспензию в две конические пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 10 мин при 200 x g.
21. Удаляйте надосадочную жидкость, не оставляя клетки на воздухе. Надосадочная жидкость будет мутной из-за клеточного мусора. Добавьте в гранулу 3 мл B27NBMA, содержащей 10% BGS.
22. Осторожно диссоциируйте клеточную гранулу с помощью пипетки P1000. Доведите объем до 15 мл с B27NBMA, содержащим 10% BGS.
23. Пропустите клеточную суспензию через свежее клеточное ситечко 40 мкм.
24. Промойте сетчатое фильтр, добавив 1 мл B27NBMA, содержащего 10% BGS. Выбросьте ситечко от ячеек.
25. Доведите объем до 30 мл с B27NBMA, содержащим 10% BGS.
26. Перенесите клеточную суспензию в 2 конические пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 10 мин при 200 x g.
27. Удалите большую часть надосадочной жидкости, не оставляя клетки на воздухе. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 5 мл ледяного буфера для сортировки магнитных клеток (MCS).

2. Определение количества клеток и жизнеспособности

1. Разбавьте 100 мкл клеточной суспензии 400 мкл раствора трипанового синего в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл для получения разведения 1:5 в 0,4% (масс./об.).
2. Расположите защитное стекло над камерой гемоцитометра и заполните две камеры 10 мкл клеточного разведения с помощью пипетки P10, избегая переполнения. Раствор будет проходить под покровным стеклом за счет капиллярного действия.
3. Поместите гемоцитометр на предметный столик микроскопа и отрегулируйте фокусировку с помощью 40-кратного увеличения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет ячеек записывается с помощью ручного счетчика в каждом из пяти квадратов (четыре угла и один центр). Только нежизнеспособные клетки поглощают краситель и кажутся синими, в то время как живые и здоровые клетки кажутся круглыми и преломляющими и не поглощают краситель синего цвета, что позволяет определить количество жизнеспособных и общее количество клеток на миллилитр.

3. Выделение олигодендроцитов O4⁺

1. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 х г в течение 10 мин.
2. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации, избегая контакта с клетками воздуха.
3. Ресуспендировать гранулу в 90 мкл буфера MCS на 1 x 10⁷ клеток с последующим добавлением 10 мкл анти-O4 гранул на 1 x 10⁷ клеток.
4. Смешайте клеточную суспензию и шарики, осторожно щелкнув пальцем по конической пробирке объемом 15 мл 4-5 раз.
5. Инкубируйте смесь в течение 15 минут при температуре 4 °C, переворачивая коническую пробирку объемом 15 мл пальцем 4-5 раз в каждые 5 минут.
6. Промойте смесь, аккуратно добавив в пробирку 2 мл буфера MCS из расчета 1 x 10⁷ клеток. Центрифугируйте смесь при 200 х г в течение 10 минут.
7. Удаляйте надосадочную жидкость осторожно с помощью вакуумной аспирации, избегая контакта с клетками воздуха. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера MCS на каждые 1 x 10⁷ клеток.
8. Прикрепите магнитный сепаратор к стенду магнитного сепаратора. Прикрепите к магнитному сепаратору колонку для отбора и поместите на нее сетчатый фильтр 40 мкм. Поместите две конические трубки объемом 15 мл или одну коническую трубку объемом 50 мл ниже разделительной колонны, чтобы собрать поток.
9. Предварительно промойте сетчатое фильтр и разделительную колонку размером 40 μм с 3 мл буфера MCS и дайте буферу пройти через колонку, не давая ей высохнуть.
10. Добавьте смесь клеточной суспензии и гранул в сетчатое фильтр и в колонку для выбора.
11. Промойте сетчатый фильтр 40 μм с 1 мл буфера MCS.
12. Выбросьте сетчатое фильтр и дайте смеси клеток, шариков и буфера пройти через колонку, не давая ей высохнуть.
13. Разделительную колонну 3 раза промыть 3 мл буфера MCS и 1 раз пролиферативной средой OL.
14. Снимите разделительную колонку с магнитного сепаратора, быстро поместите ее в коническую пробирку объемом 15 мл и сразу же добавьте 5 мл пролиферативной среды.
15. Поместите поршень на верхнюю часть колонки и сильно надавите, чтобы вымыть помеченные ячейки в коническую трубку объемом 15 мл.
16. Удалите 100 мкл клеточной суспензии для определения количества и жизнеспособности клеток с помощью Trypan Blue и гемоцитометра, как указано в разделе 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток выше 80% считается приемлемой для продолжения культивирования ОЛ, но жизнеспособность выше 90% является оптимальной.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 мл серологических пипеток	Научный центр Фишера	13-676-10Дж
Шприц 10 мл с наконечником Luer-Loc	BD, Бектон Дикинсон	309604
Конические тубы 15 мл	сокол	352097
24-луночные планшеты для культивирования тканей	сокол	353935
Сетчатый фильтр для ячеек 40 мкм	Научный центр Фишера	22368547
Конические тубы 50 мл	сокол	352098
5 мл серологических пипеток	Научный центр Фишера	13-676-10Ч
Планшеты для культивирования тканей 60 мм	сокол	353002
Сетчатый фильтр 70 мкм	Научный центр Фишера	22363548
Шарики Anti-O4- Anti-O4MicroBeads	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-094-543
Autofil Полный фильтр для бутылки в сборе, фильтр 0,22 мкм, 250 мл	США Сайентифик	6032-1101
Autofil Полный фильтр для бутылки в сборе, фильтр 0,22 мкм, 250 мл	США Сайентифик	6032-1102
Дополнение B27	Инвитроген	17504-044
Сыворотка для роста крупного рогатого скота (BGS)	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH30541.03
БСА	Научный центр Фишера	БП-1600-100
CNTF	Пепротех	450-50
Дезоксирибонуклеаза I (ДНК I)	Уортингтон	LS002007
Эдта	Научный центр Фишера	С311
Перьевые одноразовые скальпели	Андвин Сайентифик	EF7281C
глюкоза	Научный центр Фишера	Д16-1
ГлутаМАКС	Инвитроген	35050-61
инсулин	Инвитроген	12585-014
Стенд для магнитного сепаратора - MACS multistand	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-303
Магнитный сепаратор-сепаратор MiniMACS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-302
Фильтрующий блок Millex PES 0,22 мкм	Многородность	SLG033RS
Нейробазальная среда А	Инвитроген	10888-022
папаин	Уортингтон	LS003126
PBS без Ca2+ и Mg2+	сигма	Д5652
DNase I stock solution			1. Растворите при 12 500 ЕД дезоксирибонуклеазу I/мл в охлажденном на льду HBSS. 2. Фильтр стерилизовать на льду<бр /> 3. Аликвоту при 200 мкл и заморозить на ночь при -20°C.<бр/> 4. Хранить аликвоты при температуре от -20 до -30°C.
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (без Ca2+ и Mg2+)			Растворите мешочек в 1 литре воды до получения 1 литра среды из расчета 9,6 грамма порошка на литр среды. Хранить при температуре 2-8 °C.
Решение Trypan Blue	Корнинг	25-900-КИ
B27NBMA			487,75 мл нейробазальной среды А; 10 мл добавки B27; 1 мл примоцина; 1,25 мл глутамакса; Фильтр простерилизовать и хранить при температуре 4 °C до использования.
B27NBMA + 10% BGS			27 мл B27NBMA; 3 мл сыворотки для роста крупного рогатого скота
Исходный раствор CNTF (10 мкг/мл; 1000X)			Заказ в компании «Пепротех» (450-50). Составляйте от 0,1 до 1 мг/мл в соответствии с инструкцией производителя (может варьироваться от партии к партии) в буфере (например, DPBS + 0,2% BSA). Хранить при температуре -80 °C. Рабочий раствор (10 мкг/мл, 1000X)<бр/> 1. Сделать на 0,2% БСА (Fisher scientific BP-1600-100) в растворе DPBS и простерилизовать фильтр.<бр/> 2. Разведите аликвоту основного исходного материала до 10 мкг/мл в стерильном, охлажденном 0,2% BSA/DPBS. 3. Аликвота (20μл/тюбик) и мгновенная заморозка в жидком азоте.<бр/> 4. Хранить аликвоты при температуре -80 °C.
Буфер для сортировки магнитных элементов (MCS)			Приготовьте раствор, содержащий фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2 и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,5 мМ ЭДТА, 5 мкг/мл инсулина, 1 г/л глюкозы. Стерилизуйте и дегазируйте буфер путем фильтрации, пропуская его через фильтр Millex размером 0,22 мкм. Храните буфер при температуре 4°C до использования
Сбалансированные соли Хэнка (HBSS) (Sigma			1. Отмерьте в цилиндре 900 мл воды (температура 15-20 °C) и аккуратно перемешайте. 2. Добавьте мощность и перемешайте до полного растворения. 3. Промойте оригинальную упаковку небольшим количеством воды, чтобы удалить все следы порошка><. 4. Добавьте в раствор на шаге 2. 5. Добавьте 0,35 г бикарбоната натрия (7,5% по массе) на каждый литр конечного объема.<бр/> 6. Продолжайте помешивать до растворения. 7. Отрегулируйте pH буфера при перемешивании на 0,1-0,3 единицы ниже pH= 7,4, так как при фильтрации он может повыситься. Использование 1N HCl или 1N NaOH рекомендуется для регулировки pH. 8. Добавьте немного воды, чтобы довести итоговый объем до 1л.<бр/> 9. Стерилизовать фильтрацией с помощью мембраны с пористостью 0,22 мкм.<бр/> 10. Хранить при температуре 2-8 °C.