Получение микроструктурированного субстрата для изучения фенотипов шванновских клеток

Аннотация

Источник: Xu, Z., Orkwis, et al. Получение перестраиваемых микроокружений внеклеточного матрикса для оценки спецификации фенотипа шванновской клетки. J. vis. Exp. (2020).

В видео описывается приготовление микроструктурированного субстрата для изучения спецификации клеточного фенотипа. Штамп PDMS с микрорисунком, покрытый белком, используется для переноса микрорисунка на покровное стекло с покрытием PDMS. Затем покровное стекло обрабатывается поверхностно-активным веществом, препятствующим адгезии клеток на нежелательных поверхностях. Затем клетки добавляются для оседания в схеме и инкубируются для дальнейшего анализа.

Протокол

1. Подготовка и характеристика субстрата для перестраиваемых клеточных культур

1. Подготовка основания
   1. Перемешайте базовый эластомер полидиметилсилоксана (PDMS) и отвердители с помощью наконечника пипетки в соотношении от 10:1 до 60:1 до тех пор, пока пузырьки не будут равномерно диспергированы в смеси. Удалите пузырьки с помощью вакуумной сушки, пока они не рассеются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время полимеризации PDMS отвердитель сшивается с основным эластомером для обеспечения желаемых механических свойств конечного полимера. Коэффициенты сшивки могут быть отрегулированы для изменения жесткости PDMS.
   2. Нанесите каплю (~0,2 мл) высушенной смеси PDMS на квадратную или круглую защитную крышку (например, 22 мм x 22 мм) и вращайте защитную крышку на прядильной машине со скоростью 2500 об/мин в течение 30 секунд.
   3. Инкубируйте покровное стекло в духовке при температуре 60 °C в течение 1-2 часов или при комнатной температуре в течение ночи, чтобы PDMS затвердел.
   4. Обработайте покровное стекло очистителем UV-Ozone в течение 7 минут (длина волны UV: 185 нм и 254 нм) для повышения гидрофильности поверхности. Поместите его в стерилизованную 6-луночную тарелку.
   5. Перед использованием для культивирования клеток инкубируйте субстраты в 70% этаноле не менее 30 минут.
      ВНИМАНИЕ: УФ-озоновый очиститель может выделять озон, вредный для человека. Работайте в вытяжном шкафу для химикатов или с какой-либо формой вентиляции.
2. Подготовка подложки с микрорисунком
   1. Нарисуйте желаемую геометрию и адгезивные участки ячеек (900^мкм2, 1 600^мкм2 и 2 500^мкм2) с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (САПР). Создайте хромированный фотошаблон на основе этих шаблонов от коммерческого поставщика.
   2. В чистом помещении или в защищенной от пыли среде используйте стандартные методы фотолитографии для изготовления кремниевых пластин. Критические параметры для данного конкретного применения следующие: Фоторезист: СУ-8 2010; Профиль вращения для рассеивания фоторезиста: 500 об/мин в течение 10 с с ускорением 100 об/мин, затем 3500 об/мин в течение 30 с с ускорением 300 об/мин; Энергия воздействия ультрафиолетового излучения: 130 мДж/см2,<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Высота шаблонов на кремниевых пластинах составляет примерно 10 мкм в соответствии с этими параметрами. Потенциальные трещины по краю за пределами прямоугольных или треугольных узоров можно увидеть с помощью светового микроскопа после шага 1.2.2. Запекание силиконовой пластины при 190 °C в течение 30 минут помогает устранить трещины.
   3. Поместите кремниевую пластину с рисунком в круглую чашку Петри диаметром 150 мм и высотой 15 мм и вылейте дегазированный PDMS (соотношение смешивания 10:1) в соответствии с этапом 1.1.1 на кремниевую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что толщина PDMS составляет не менее 5 мм, чтобы облегчить работу во время микроконтактной печати.
   4. Затвердейте PDMS на силиконовой пластине в духовке при температуре 60 °C в течение ночи. Дайте PDMS остыть до комнатной температуры. Точно вырежьте квадратные штампы размером 30 мм x 30 мм с правильными узорами из силиконовой пластины с помощью хирургического скальпеля. Не повреждайте кремниевую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе кремниевые пластины можно использовать многократно для получения большего количества штампов после очистки изопропанолом.
   5. Стерилизуйте штампы PDMS и настраиваемые покровные стекла (подготовленные в соответствии с шагами 1.1.1 - 1.1.3), погрузив их в 70% этанол на 30 минут.
   6. Для подтверждения эффективности микрорисунка на марках PDMS после микроконтактной печати поверхность марок PDMS необходимо высушить с помощью потока фильтрованного воздуха и дозатора раствора 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) (конъюгированный Texas Red) для покрытия всей стороны марки PDMS с рисунком.
   7. Инкубируйте штампы PDMS с раствором BSA в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы обеспечить адсорбцию белка.
   8. Высушите поверхность тюнинговых покровных стекол с помощью потока отфильтрованного воздуха и увеличьте гидрофильность поверхности, как описано в шаге 1.1.5.
   9. Высушите штампы PDMS на воздухе для удаления остатков раствора BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы раствор BSA был полностью удален с марки, так как любой оставшийся раствор приведет к скольжению марок по покровному листу во время микроконтактной печати.
   10. Приведите узорчатую сторону штампа в конформный контакт с настраиваемым покровным стеклом для адсорбции BSA на поверхности покровного стекла. Аккуратно прижмите штамп к покровному листу в течение 5 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикладывайте чрезмерного усилия к штампу, так как он может согнуться и вызвать неспецифический контакт между маркой и покровным листом. Соответствующее усилие, приложенное к штампу, имеет важное значение для успешной микроконтактной печати.
   11. Исследуйте микрокартину с помощью флуоресцентного микроскопа с фильтром FITC (флуоресцеин изотиоцианат).
   12. Чтобы напечатать клеточные адгезивные участки, а не флуоресцентные узоры, замените белок BSA ламинином и повторите шаги с 1.2.5 по 1.2.10.
   13. Удалите штампы с покровных стекол и переложите покровные листы в стерилизованную 6-луночную пластину. Добавьте 2 мл 0,2% масс.в/в раствора Pluronic F-127 в каждую лунку, чтобы покрыть поверхность покровного стекла, и выдерживайте в течение 1 часа при комнатной температуре.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Плуроновый F-127 может быть адсорбирован на поверхности PDMS, увеличивая гидрофобность поверхности PDMS, блокируя клетки от адгезии.
   14. Аспирируйте раствор F-127 и промойте 5 раз фосфатным буферным раствором (PBS) и 1 раз средой для культивирования клеток перед посевом клеток. Типичная плотность высева для СК составляет 1 000 ячеек^/см2.
   15. Через 45 минут после посева клеток удалите среду для клеточных культур и промойте покровные стекла PBS 2x, чтобы предотвратить прилипание нескольких SC к одному и тому же рисунку. Выдерживайте клетки в желаемой среде для культивирования клеток в течение 48 часов перед количественным измерением.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Альбумин из бычьей сыворотки (BSA), конъюгат Texas Red	Thermo Fisher Scientific	А23017	Окрашивание BSA для отображения микроузоров
Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco	Thermo Fisher Scientific	11965092	Среда для культивирования клеток
Фетальная бычья сыворотка	Thermo Fisher Scientific	16000044	Среда для клеточных культур дополнительная
Фибронектин	Thermo Fisher Scientific	33010-018 (Английский)	Белок, используемый для покрытия покровных накладок
Флуоресцентный микроскоп	Компания Nikon	Затмение Ti2	Флуоресцентный микроскоп
Ламинин	Thermo Fisher Scientific	23017015	Белок, используемый для покрытия покровных накладок
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140122	Среда для клеточных культур дополнительная
Плуронический F-127	Сигма Олдрич	-2443	Блокирование неспецифического связывания с белками
SYLGARD 184 PDMS база и отвердитель	Сигма Олдрич	761036	Настраиваемый полимер, используемый для покрытия покровных слипов
УФ-озоновый очиститель	Новаскан		Повышение гидрофичности PDMS