Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение и культивирование моторных и сенсорных нервных фибробластов и СК (шванновских клеток)
- Используйте семидневных крыс породы Спрэг-Доули (SD) (n=4) из Центра экспериментальных животных Университета Наньтун в Китае. Поместите крыс в резервуар с 5% изофлураном на 2-3 минуты, дайте животным медленно дышать и не проявлять самостоятельной активности, а затем продезинфицируйте с использованием 75% этанола перед обезглавливанием.
- С помощью ножниц разрежьте кожу задней части примерно на 3 см и удалите позвоночный столб. Осторожно откройте позвоночный канал, чтобы обнажить спинной мозг.
- Поддерживайте спинной мозг в чашке Петри диаметром 60 мм с 2-3 мл ледяного сбалансированного солевого раствора D-Hanks (HBSS).
- Исходя из анатомического строения, иссекают вентральный корешок (двигательный нерв), а затем дорсальный корешок (чувствительный нерв) под рассекающим микроскопом. Затем поместите их в ледяной сбалансированный солевой раствор Д-Хэнкса (HBSS).
- После удаления HBSS разрежьте нервы на кусочки по 3-5 мм ножницами и расщепите 1 мл 0,25% (w/v) трипсина при 37 °C в течение 18-20 минут. Затем добавьте 3-4 мл DMEM, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы остановить пищеварение.
- Осторожно дозируйте смесь вверх и вниз около десяти раз и центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут. После этого выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте осадок в 2-3 мл DMEM с добавлением 10% FBS.
- Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью фильтра 400 меш, затем инокулируйте клетки в чашке Петри диаметром 60 мм и культивируйте при 37 °C в 5% CO2. Через 4-5 дней культивирования выделяют пассаж 0 (p0) фибробластов и СК после достижения 90% конфлюенции.
- Изоляция и культура СК (Рисунок 1)
- Промойте клетки один раз, используя 1x PBS. Добавьте 1 мл 0,25% (мас./об.) трипсина (37 °C) на чашку Петри диаметром 60 мм, чтобы переварить клетки в течение 8-10 с при комнатной температуре. После этого добавляли 3 мл DMEM с добавлением 10% FBS для остановки пищеварения.
- Аккуратно продуйте смесь пипеткой, чтобы отделить СК. Затем соберите и центрифугируйте СК при давлении 800 x g в течение 5 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте остаток в 3 мл DMEM с 10% FBS, 1% пенициллином/стрептомицином, 2 мкМ форсколином и 10 нг/мл HRG, а затем инокулируйте клетки в чашку Петри 60 мм без покрытия. После культивирования при 37 °C в течение 30-45 мин фибробласты (несколько фибробластов перевариваются с помощью SCs) прикрепляются к дну чашки.
- Перенесите надосадочную жидкость (включая СК) в другую среднюю чашку, покрытую поли-L-лизином (ФАПЧ), и закваливайте при температуре 37 °C в течение 2 дней.
