$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление культуры эндотелия мыши в проницаемых вспомогательных вставках
ПРИМЕЧАНИЕ: Элементы BEND3 поддерживаются в соответствии с инструкциями производителя.
- Приготовьте клеточную среду (БМ) BEND3, добавив 50 мл FBS и 5 мл пенициллин-стрептомицина в 500 мл DMEM и хорошо перемешайте.
- Отсадите среду из чашки и промойте культуру клеток BEND3 1 мл PBS один раз. Добавьте в клетки 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и инкубируйте их в течение 4 мин при 37 °C.
- Добавьте 1 мл BM в клетки, чтобы нейтрализовать трипсин-ЭДТА, и осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы полностью диссоциировать клетки. Перенесите суспензию клетки в новую коническую пробирку объемом 15 мл и получите гранулу центрифугированием при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут при 400 x g.
- Отсадите надосадочную жидкость из пробирки и повторно суспендируйте клетки 9 мл свежей БМ, затем добавьте 1 мл клеточной суспензии в одну проницаемую поддерживающую вставку. Добавьте еще 2 мл свежего БМ на лунку в нижнюю камеру матрицы. Продолжайте культивировать клетки в течение одного дня.
2. Настройка нейроэндотелиальной кокультуры и системы маркировки Ac4ManNAz
- Однажды, после гальванизации ячеек BEND3 во вставках, осторожно отсасывайте среду сначала в нижней камере, а затем во вставках. Промойте лицевую сторону вставок 3 раза предварительно подогретым DMEM (модифицированная среда Dulbecco eagle). Вымойте внешнюю поверхность вставок путем промывки предварительно подогретым DMEM.
- Добавьте 1 мл предварительно подогретого АМ (адгезивной среды) в одну вставку, затем перенесите вставки в лунки с первичными клетками коры головного мозга. Инкубируйте совместную культуру при 37 °C и 5%CO2 в течение 12 часов.
- Растворите Ac4ManNAz в ДМСО (диметилсульфоксиде) до достижения исходной концентрации 200 мМ. Через 12 ч после создания нейроэндотелиальной кокультуры добавьте 1 мкл исходного материала Ac4ManNAz на нижнюю камеру и 0,5 мкл исходного материала на каждую вставку в ко-культуру. Сразу же и осторожно встряхните пластины, чтобы хорошо перемешать среду. Для контрольных ячеек добавьте равный объем ДМСО.
- Культивируйте клетки еще 5 дней при 37 °C и 5%CO2. Приготовьте АП с 10x bFGF в качестве питательной среды (RM). В течение этого времени добавьте 100 μL RM на каждую вставку и 200 μL RM на нижнюю камеру для повторного питания эндотелиальных и нервных клеток через день. Во время повторного кормления не вводите в культуру Ac4ManNAz или ДМСО.