Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Растворы и лекарства
- Физиологический раствор соли (ПСС)
- Приготовьте минимум 1 л PSS, используя 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазина-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) и 10 мМ глюкозы.
- Приготовьте необходимые растворы с недостаточным CaCl2 (ноль Ca2+ PSS) для рассечения артериол головного мозга и выделения эндотелиальной трубки.
заметка: Все растворы готовят в ультрачистом деионизированном H2O с последующей фильтрацией (0,22 мкм). Убедитесь, что конечный продукт содержит pH 7,4 с осмоляльностью от 290 до 300 мОсм.
- Бычий сывороточный альбумин (BSA, 10%)
- Растворите 1 г лиофилизированного порошка БСА в стакане с 10 мл нулевогоCa2+ PSS. Накройте стакан крышкой и оставьте не менее 2 часов при медленном помешивании, чтобы BSA растворился.
- Отфильтруйте раствор с помощью шприца объемом 10 мл и фильтра 0,22 мкм и приготовьте аликвоты объемом 1 мл для хранения при температуре -20 °С.
- Диссекционный раствор
- Добавьте 500 мкл БСА (10%) к 49,5 мл нулевогоCa2+ PSS для получения общего объема 50 мл.
- Переложите раствор в чашку Петри для артериолярных диссекций.
- Решение для диссоциации
- Добавьте 5 мкл раствора CaCl2 (1 М) и 500 мкл БСА (10%) к 49,5 мл нулевогоCa2+ PSS, чтобы получить общий объем 50 мл. Инкубируйте раствор при комнатной температуре не менее 1 ч.
- Ферментов
- Приготовьте 1 мл раствора для сбраживания со 100 мкг/мл папаина, 170 мкг/мл дитиоэритритола, 250 мкг/мл коллагеназы (смесь типа H) и 40 мкг/мл эластазы.
заметка: Активность ферментов может варьироваться, хотя успешные протоколы, вероятно, потребуют следующих ферментативных активностей: ≥ 10 ЕД/мг для папаина, ≥ 1 ЕД/мг для коллагеназы и ≥ 5 ЕД/мг для эластазы><.
2. Выделение паренхиматозных артериол
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола выбраны артериолы, возникающие из средних мозговых артерий (МКА) и встроенные в паренхиму мозга. Артериолы выделяют, как описано ранее11, с модификацией.
- Стальными штифтами (диаметр: 0,2 мм, длина: от 11 до 12 мм) закрепите изолированный мозг в холодном растворе для препарирования в чашке Петри, содержащей полимерное покрытие из древесного угля (глубина ≥ 50 см).
- С помощью острых и выровненных ножниц для препарирования разрежьте прямоугольник ткани мозга (длина: 5 мм, ширина: 3 мм) (Рисунок 1B) вокруг MCA, следя за тем, чтобы верхняя часть сегмента ткани находилась за точкой разветвления от Виллисова круга. Вырежьте еще один прямоугольник мозговой ткани из другого полушария мозга, чтобы при необходимости получить доступ к большему количеству артериол.
- Закрепите отделенный сегмент мозговой ткани в чашке так, чтобы МКА была обращена вверх (дистальнее Виллисовского круга) с помощью стальных штифтов (диаметр: 0,1 мм, длина: от 13 до 14 мм). Осторожно сделайте неглубокий надрез возле штифтов, чтобы удалить пиа небольшими щипцами, аккуратно отшелушивая от одного конца к другому (рисунок 1В). Удалите пиа из другого сегмента ткани, чтобы получить доступ к большему количеству артериол, если это необходимо. Тщательно закрепите изолированную пиа с паренхиматозными артериолами, ответвленными от МКА, в чашке с помощью штифтов и препарируйте паренхиматозные артериолы (рис. 1D), убедившись, что артериолы не повреждены.
заметка: Если артериолы не так легко вытягиваются с помощью пиа из паренхимы, используйте тонкие щипцы и вкопайтесь в мозг, начиная с точки ветви МСА от Виллисова круга. Найдите артериолу, осторожно ослабьте ткань вокруг артериол (рисунок 1E) и осторожно вытяните артериолу из паренхимы, удерживая верхний конец артериолы (рисунок 1F). Из одного прямоугольника мозговой ткани можно выделить множественные артериолы (длина: ~1,5-2 мм).
- Убедитесь, что артериола чистая, к ней не прикреплена ткань, и отрежьте все оставшиеся дистальные ветви (рисунок 2A). Используйте эту чистую, неповрежденную артериолу для ферментативного пищеварения. В качестве альтернативы разрежьте каждую артериолу на две части (длина: 0,75-1 мм) для ферментативного расщепления для подготовки эндотелиальных трубок, если это необходимо.
3. Переваривание паренхиматозных артериол и подготовка эндотелиальных трубок
- Расстановка оборудования и пипеток
заметка: Выделение артериальных эндотелиальных трубок из головного мозга было описано ранее13,18. Текущий протокол включает в себя модификации для выделения эндотелия из паренхиматозных (внутримозговых) артериол. Несколько артериол и/или кусочков артериол могут быть использованы вместе для ферментативного пищеварения.
- Соберите аппарат для растирания13 для подготовки эндотелиальных трубок с использованием алюминиевого столика, поддерживающего камеру и микроманипуляторы. Соберите микроскоп с объективами (5x-60x) и камерой, подключенной к монитору компьютера. Закрепите микрошприц с контроллером насоса рядом с предметным столиком и образцом.
- Закрепите пипетку для растирания, наполненную минеральным маслом, над поршнем микрошприца. С помощью микрошприца с контроллером насоса введите диссоциативный раствор в пипетку для растирания (~130 нл) поверх минерального масла, стараясь при этом не допустить образования пузырьков воздуха в пипетке.
- Частичное сбраживание артериолярных сегментов
- Поместите интактные артериолярные сегменты в 1 мл диссоциационного раствора в стеклянную пробирку объемом 10 мл, содержащую 100 мкг/мл папаина, 170 мкг/мл дитиоэритритола, 250 мкг/мл коллагеназы и 40 мкг/мл эластазы. Инкубировать артериальные сегменты при температуре 34 °C в течение 10-12 минут.
- После разложения замените ферментный раствор 3-4 мл свежего диссоциационного раствора комнатной температуры.
- Выделение артериальной эндотелиальной трубки
ПРИМЕЧАНИЕ: После разложения и замены ферментного раствора перенесите один или несколько частично расщепленных сегментов в диссоциационный раствор в камере суперфузионного синтеза, прикрепленной к мобильной платформе. При просмотре со 100-200-кратным увеличением выберите один частично переваренный, но неразрывный сегмент сосуда и сфокусируйтесь на нем под микроскопом.
- Поместите пипетку для растирания, прикрепленную к инжектору микрошприца, в раствор для диссоциации в камере и расположите ее близко к одному концу сегмента расщепленного сосуда. Установите скорость в диапазоне 1-3 нл/с на контроллере насоса для мягкого растирания.
- Поддерживая увеличение от 100 до 200 раз, выведите артериолярный сегмент в пипетку, а затем извлеките его, чтобы диссоциировать адвентицию и гладкомышечные клетки (рис. 1B). Растирайте сегмент сосуда до тех пор, пока все гладкомышечные клетки не будут диссоциированы, и только эндотелиальные клетки останутся в виде неповрежденной «трубки><».
заметка: При необходимости во время растирания осторожно с помощью щипцов с тонким наконечником удалите диссоциированную адвентицию и внутреннюю эластическую пластинку из эндотелиальной трубки. Как правило, только несколько циклов растирания дают неповрежденную эндотелиальную трубку.
- С помощью микроманипуляторов закрепите каждый конец эндотелиальной трубки на стеклянном покровном стеколе в камере с помощью пипеток из боросиликатного стекла (рис. 2C, D).
- Обеспечение безопасности артериолярного эндотелиального трубка
- Замените раствор для диссоциации раствором суперфузии (PSS, содержащим 2 мМ CaCl2), обеспечивая при этом вымывание неэндотелиального материала из камеры.
- Перенесите защищенную эндотелиальную трубку на мобильной платформе в микроскоп, предназначенный для непрерывной суперфузионной и внутриклеточной или флуоресцентной записи/визуализации.
- Применяйте непрерывную подачу PSS во время эксперимента. Вручную устанавливайте расход (5-7 мл/мин) на протяжении всего эксперимента с помощью встроенного клапана регулирования потока, согласуя его с ламинарным потоком, при этом подавайте раствор расходуется в соответствии со степенью вакуумного всасывания. Дайте ≥5 минуты потоку PSS в камеру для суперфузии эндотелиальной трубки перед получением фоновых данных и/или загрузкой красителя.
