Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Рассечение межпозвоночного диска крупного рогатого
скота
- Тщательно промойте весь хвост водой из-под крана, чтобы удалить грязь и шерсть с поверхности><.
заметка: При неповрежденных, дистальных концах для экспериментов можно использовать максимум 9 межпозвоночных дисков (IVD) (копчиковый 1-9) на хвост в зависимости от желаемого размера IVD. Учитывая желаемый диаметр от 15 до 20 мм, для экспериментов мы использовали 12 бычьих хвостов с 5 IVD на каждый хвост.
- Погрузите весь хвост в коробку, содержащую 1% раствор бетадина, на 10 мин. Кратковременно обсушите хвост стерильной марлей и положите его на стерильную простыню.
заметка: Во время вскрытия диска увлажняйте хвосты смоченной марлей раствором Рингера для предотвращения обезвоживания. Храните хвосты (или оставшиеся сегменты) завернутыми во влажную марлю до тех пор, пока не будет завершена вся процедура вскрытия.
- С помощью скальпеля (No 20) удалите мягкие ткани из каудального отдела позвоночника как можно полнее, чтобы облегчить идентификацию IVD. Удалить остистые и поперечные отростки позвонков плоскогубцами для удаления кости.
заметка: Подбирайте ИВД с нужным диаметром. В настоящем исследовании использовались ИВД с диапазоном диаметров 15-20 мм.
- Разрежьте поперечно костными плоскогубцами середину тела каждого позвонка, чтобы получить отдельные подвижные сегменты. Поместите отрезки движения в чашку Петри с марлей, смоченной в растворе Рингера.
- Найдите IVD и позвонок с помощью пальпации и осторожного перемещения двигательных сегментов. Сделайте два параллельных пропила ленточной пилой в ростовой пластине IVD, по одному с каждой стороны IVD. Определите расположение пластинки роста путем прикосновения и нахождения выпуклого участка костной части торцевой пластины (твердой), прилегающей к диску (мягкой) с безопасным расстоянием примерно 0,5-1 мм от ИВД в сторону позвонка. Убедитесь, что лезвие ленточной пилы охлаждается раствором Рингера во время резки позвонков.
- Перенесите IVD в чистую чашку Петри с чистой марлей, смоченной раствором Рингера.
заметка: Марля должна быть увлажненной и не слишком мокрой, чтобы не допустить отека ИВД,
- Лезвием скальпеля соскребите тело позвонка (красная/розовая кость), пластинку роста (белый хрящ), оставьте торцевую пластину нетронутой (желто-розовая). Сделайте две поверхности плоскими и параллельными для процедуры загрузки. Перенесите соскобленные IVD в свежую чашку Петри с марлей, смоченной раствором Рингера.
заметка: Надевайте кольчужную перчатку, чтобы защитить руку, держа IVD и соскабливая ее.
- Измерьте высоту и диаметр диска с помощью штангенциркуля. Очистите сгустки крови в кости позвонков раствором Рингера с помощью системы струйного промывания крови.
- Перенесите ИВД в пластиковые пробирки объемом 50 мл, по одному ИВД на трубку. Добавьте 25 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) + 10% пенициллин/стрептомицин (P/S) на IVD и оставьте встряхивать в течение 15 минут на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 10 мл PBS + 1% P/S на каждые IVD в течение 2 мин для промывания IVD.
2. Культура и загрузка IVD
- Перенесите диски в камеры ИВД и добавьте питательную среду для ИВД (модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM, 4,5 г/л DMEM с высоким содержанием глюкозы для физиологической группы и 2 г/л DMEM с низким содержанием глюкозы для патологической группы) + 1% P/S + 2% сыворотка теленка плода + 1% ITS (содержит 5 мкг/мл инсулина, 6 мкг/мл трансферрина, и 5 нг/мл селеновой кислоты) + 50 мкг/мл аскорбат-2-фосфата + 1% заменимой аминокислоты + 50 мкг/мл антимикробного средства для первичных клеток) и поместить в инкубатор при 37 °C, 85% влажности и 5%CO2.
- Культивировать диски в течение 4 суток в биореакторной системе по опытным группам. В патологической группе поддерживают условия дегенеративной нагрузки на уровне 0,32-0,5 МПа, 5 Гц в течение 2 ч/сут. В физиологической контрольной группе используют протокол нагрузки 0,02-0,2 МПа, 0,2 Гц в течение 2 ч/сут.<бр/>
заметка: Во время загрузочных процедур устанавливайте ИВД в камеры, содержащие 5 мл среды ИВД. Объем зависит от размера загрузочных камер биореактора. Между нагрузочными процедурами поместите IVD в шестилуночные планшеты с 7 мл питательной среды IVD для восстановления свободно набухающего.
- Для анализа изменения высоты диска в течение экспериментального периода измеряют высоту диска штангенциркулем после ИВД (исходный уровень), а затем ежедневно после периода свободного набухания и после динамической нагрузки в течение всего периода эксперимента.
