Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в нейронах с использованием сконструированных лентивирусов

Abstract

Источник: Assetta, B., et al., Генерация нейронов человека и олигодендроцитов из плюрипотентных стволовых клеток для моделирования нейрон-олигодендроцитарных взаимодействий. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует процесс стимуляции человеческих плюрипотентных стволовых клеток к дифференцировке в нейроны путем их трансфекции с помощью сконструированных лентивирусов, несущих ген нейрогенного фактора транскрипции под контролем тетрациклин-чувствительного элемента, с последующим лечением производным тетрациклина и средой созревания.

Protocol

1. Индукция нейронов человека из плюрипотентных стволовых клеток человека

1. Подготовка к лентивирусу (~5 дней, подробный протокол, как описано ранее)
   1. Поместите ~1 миллион HEK293T клеток в каждую колбу T75, чтобы они сливались на ~40% при выполнении трансфекции. Трансфектируйте их плазмидами, экспрессирующими тетрациклин-индуцируемый Ngn2 и устойчивый к пуромицину ген (PuroR; под тем же контролем промотора TetO), rtTA, а также три хелперные плазмиды pRSV-REV, pMDLg/pRRE и VSV-G (12 г лентивирусной векторной ДНК и 6 мкг каждой из хелперных плазмидных ДНК). Подготовьте не менее трех колб на один препарат лентивируса. Используйте PEI для трансфекции, следуя инструкциям производителя. Смените носитель через 16 часов и выбросьте.
   2. Собирайте высвободившиеся вирусные частицы путем сбора питательных сред каждый день и заменяйте свежими средами на 3 дня. Объедините собранные среды, содержащие вирусные частицы, для очистки. Отфильтруйте вирус через фильтр 0,22 мкм и центрифугируйте при 49 000 x g в течение 90 минут. Ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме PBS-глюкозы (~150 μл).
2. Индукция нейронов (~5 дней)
   заметка: Этот протокол индукции (рис. 1A; блок-схема) очень эффективен как для iPS, так и для ES-клеток валидированной плюрипотентности (которые могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимического окрашивания хорошо охарактеризованных маркеров плюрипотентности; Рисунок 1B).
   1. Используйте коммерчески доступные H1 человеческие ES-клетки на прохождении 52 (см. Таблицу материалов). Культивируйте клетки на 6-луночных планшетах, покрытых внеклеточным матриксным раствором (~0,5 мг матриксного раствора на 6-луночный планшет; см. Таблицу материалов) с использованием среды для поддержания ES-клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируйте планшеты при 37 °C с 5%_CO2.
   2. На 2-й день отделите клетки ЭС (80% конфлюента) с 1 мл раствора для отделения клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин. Переложите клетки в пробирку; промойте лунку 2 мл среды и соедините в той же пробирке. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут, повторно суспендируйте гранулу в среде и поместите ячейки на 6-луночные планшеты с матричным покрытием с плотностью посева 1 x 10₅ клеток на лунку.
   3. В день -1 добавьте лентивирусы, экспрессирующие Ngn2 плюс PuroR и rtTA, вместе с полибреном (8 мкг/мл) к ES-клеткам в свежей среде для поддержания ES-клеток (см. Таблицу материалов). Точное количество вирусов должно определяться фактическими титрами или титрованием. Обычно мы добавляем по 5 мкл каждого вируса на лунку в 6-луночном планшете.
   4. В день 0 добавить Доксициклин (2 мкг/мл для активации экспрессии Ngn2) в среду DMEM-F12 с добавкой N2 без морфогенов.
   5. В 1-й день добавьте пуромицин в свежую среду DMEM-F12 плюс N2 и доксициклин до конечной концентрации 1 мкг/мл среды. Отбирайте трансдуцированные клетки в пуромицине в течение не менее 24 ч. Более высокая концентрация пуромицина (до 5 г/мл) и более длительный период отбора (до 48 ч) могут потребоваться для адекватного удаления недостаточно трансдуцированных клеток, если титр вируса низкий.
   6. На 2-й день дифференцирующие нейроны отделяют раствором для отслойки клеток (см. Таблицу материалов), повторно помещают их на 24-луночные планшеты (от 80 000 до 200 000 клеток/лунку), покрытые матричным раствором (см. Таблицу материалов), и поддерживают их в среде NBA/B27 без доксициклина. Плотность посева имеет решающее значение.
   7. На этом этапе оторванные нейроны могут быть заморожены в специализированной коммерческой среде для замораживания (см. Таблицу материалов) и храниться в жидком азоте до 3 месяцев. Чистые нейроны могут быть покрыты с учетом типичной гибели ~15–20% клеток после оттаивания, культивироваться отдельно или совместно с другими типами клеток мозга.
   8. Культивируйте чистые iN на планшетах, покрытых растворами на основе внеклеточного матрикса в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Характерная пирамидальная морфология должна стать очевидной к 4-му дню (и 6-му дню; Рисунок 1С). Образование синапсов может быть обнаружено уже на 14-16 день и заметно на 24 день при иммуногистохимическом окрашивании стандартными пре- и постсинаптическими маркерами. (Рисунок 1D; помечен пресинаптическим маркером Synapsin 1 и дендритным маркером Map2).

Results

Рисунок 1: Прямая генерация индуцированных человеком нейронов (iN) из hPSCs. (А) Блок-схема генерации iN. (B) Репрезентативные изображения светлого поля и иммунофлуоресцентные изображения исходной культуры плюрипотентных стволовых клеток человека (H1) для подтверждения плюрипотентности. Oct4 показан красным цветом, а Sox2 — зеленым. (C) Репрезента...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Аккутаза	Технологии стволовых клеток	7920
Доплата B27	ТермоФишер	17504044
Средний DMEM/F12	Технологии стволовых клеток	No 36254
Дмсо	ТермоФишер	Д12345
Доксициклин	МиллипорСигма	Д3072
H1 человеческие ES-клетки	WiCell	ВА01
Матригель	Корнинг	354234
mTeSR плюс	Технологии стволовых клеток	No 5825
Доплата N2	ТермоФишер	17502001
Нейробазальная среда А	ТермоФишер	10888-022
Заменимые аминокислоты	ТермоФишер	11140-050
ОПЭ	ВВР	71002-812
pMDLg/pRRE	Адджен	No 12251
Полибрен	МиллипорСигма	ТР-1003-Г
пРСВ-РЭВ	Адджен	No 12253
Пуромицин	ТермоФишер	A1113803
STEMdiff Neural Progenitor для замораживания сред	Технологии стволовых клеток	No 5838
Набор для нейронной индукции STEMdiff SMADi	Технологии стволовых клеток	8581
Tempo-iOlogo: OPCs, полученные из иПСК человека	Темпо БиоНаука	Артикул102
TetO-Ng2-Puro	Адджен	No 52047
ВСВ-Г	Адджен	No 12259