Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши в сетевую популяцию нейронов

Abstract

Источник: Hubbard, K. et al., Функциональная оценка биологических нейротоксинов в сетевых культурах нейронов центральной нервной системы, полученных из стволовых клеток.J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует технику дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в сетевую популяцию нейронов с функционирующими синапсами. В нем описаны этапы, связанные с дифференцировкой эмбриональных стволовых клеток в нейроны, индукцией формирования нейронной сети и обогащением культуры сетевыми нейронами.

Protocol

1. Дифференцировка нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.1 - 1.5 до полудня и шаг 1.7 после полудня. Обзор процедур дифференцировки представлен на рисунке 1А.

1. Перелейте 350 μл (3,5 x 10⁶) ЭСК в 10-сантиметровую чашку с низким уровнем прикрепления, содержащую 25 мл дифференцировочной среды. Поместите в орбитальный шейкер с частотой вращения 30 - 45 об/мин в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C с 5%_CO2. Это первый день дифференцировки, называемый днем in vitro (DIV) -8,< бр/> заметка: Использование чашки со сверхнизкой присадкой увеличивает стоимость метода, но дает несколько больший выход, чем бактериальные чашки Петри, поскольку заполнители могут иногда прилипать к чашкам Петри. Если вы предпочитаете чашки разных размеров, средние объемы и количество ячеек могут быть масштабированы соответствующим образом.
2. Через 48 часов (DIV -6) с помощью пипетки объемом 25 мл переведите дифференцирующие клеточные агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Сразу же добавьте в чашку Петри свежие 25 мл дифференцировочной среды.
3. Дайте заполнителям осесть в течение 2 - 5 минут, образуя видимую гранулу глубиной 1 - 2 мм. Игнорируйте отдельные клетки или небольшие агрегаты, оставшиеся во взвешенном состоянии. Осторожно отсадите среду и перенесите клеточную гранулу обратно в чашку Петри с помощью P1000. Поместите на ротационный шейкер в инкубатор для культуры тканей.
4. В DIV -4 повторите шаг 1.2. Гранула будет иметь глубину 2 - 4 мм. Замените 30 мл дифференцировочной среды с добавлением 6 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА) в чашку Петри. Вернитесь к ротационному встряхивателю в инкубаторе для культивирования тканей еще на 48 часов.
5. В DIV -2 повторите шаг 1.3. На этом этапе гранула будет иметь глубину 4 - 8 мм.
6. В DIV -1 подготовьте поверхности для гальванического покрытия, как указано в разделе 2.
7. При DIV 0 разморозьте 5 мл предварительно аликвотированной и замороженной среды для трипсинизации NPC при 37 °C в течение 5 - 10 мин и поместите в колпак для культуры тканей. С помощью пипетки объемом 25 мл перенесите дифференцирующие агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Дайте заполнителям осесть и осторожно аспирируйте среду. Промойте гранулу дважды 10 мл PBS, дав заполнителям осесть между промывками.
8. После второй промывки PBS добавьте в гранулу 5 мл среды для трипсинизации NPC и выдерживайте при 37 °C в течение 5 мин. Осторожно переверните пробирку через 2,5 мин.
9. Добавьте 5 мл 0,1% ингибитора трипсина сои (ИППП) для инактивации трипсина и перемешайте путем инвертирования. Осторожно растирайте 10–15 раз серологической пипеткой объемом 10 мл до получения относительно однородной клеточной суспензии.
10. Медленно перенесите клеточную суспензию в клеточный фильтр размером 40 мкм или 70 мкм, помещенный на верхнюю часть конической пробирки объемом 50 мл. После того, как вся суспензия будет отфильтрована, добавьте 1 мл среды N2, чтобы промыть оставшиеся клетки через фильтр, и гранулируйте диссоциированную клеточную суспензию в течение 6 минут при 200 х г.
11. Отсаживайте среду, не нарушая гранулы. Дважды промойте ячейки средой N2 объемом 10 мл, гранулируя ячейки в течение 5 минут при плотности 200 x g и растирая между стирками с помощью P1000. Перед вторым промывкой подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
12. Ресуспендируйте клетки в среде N2 со скоростью 1 x 10⁷ клеток/мл и пластинчатыми ESN с плотностью клеток 150 000 - 200 000 клеток/^см2.
13. Перенесите только что нанесенные ЭСН в инкубатор для увлажненных культур тканей при температуре 37 °C и 5%_CO2 и храните, как описано в разделе 3.

2. Подготовка поверхностей культуры для осаждения нейронных предшественников в DIV 0

1. Готовьте блюда, обработанные тканевыми культурами, не менее чем за 1 день до сервировки. Добавьте достаточное количество полиэтиленимина (PEI; 25 мкг/мл в стерильном H₂O) или поли-D-лизина (PDL; 100 мкг/мл в стерильном H₂O) для покрытия пластиковой посуды, обработанной культурой тканей, и инкубируйте O/N при 37 °C.
2. Утром в день сервировки дважды вымойте посуду двойным дистиллятором H₂O и один раз PBS. После окончательного мытья добавьте достаточное количество N2 среды, чтобы покрыть посуду (например, 1 мл на лунку 12-луночной посуды или 4 мл на 6-сантиметровую посуду).
3. Подготовьте стеклянные покровные стекла толщиной 18 мм не менее чем за сутки до нанесения нейронного покрытия. Очистите покровные стекла плазменной очисткой в течение 4 минут.
4. Немедленно переложите очищенные покровные листы на промытую этанолом парапленку на дно большой стерильной посуды и добавьте 400 мкл раствора PEI или PDL, приготовленного как в пункте 2.1. Инкубируйте Н/Н при 37 °C в инкубаторе для культуры тканей.
5. Утром промойте покровные стекла три раза водой и добавьте 5 мкг/мл ламинина в PBS на 1 - 3 часа при 37 °C. Перед диссоциацией нейронов аспирируйте ламинин и немедленно перенесите покровное стекло в лунку 12-луночной чашки, содержащей 1 мл среды NPC, обязательно держа обработанной стороной вверх.
6. Храните посуду и покровные стекла при температуре 37 °C, пока NPC не будут готовы к подаче на тарелку.

3. Обслуживание нейронов

1. В DIV 1 аспирируйте среду и замените ее питательной средой N2.
2. В разделах 2 и 4 аспирируйте среду и замените питательной средой B27.
3. В DIV 8 аспирируйте среду и замените ее культуральной средой B27, содержащей ингибиторы митоза, для устранения загрязняющих ненейрональных клеток.
4. В DIV 12 замените на культуральную среду B27.
5. Не удаляйте DIV 12⁺ ESN с 5%_CO2 до тех пор, пока не будете готовы к использованию.

Results

Рисунок 1. Адаптированные к суспензии ЭСН остаются митотически стабильными и экспрессируют маркеры плюрипотентности.а) Схема технического обслуживания и дифференциации ЭКУ. Наличие или отсутствие ретиноевой кислоты (РА) или фактора, ингибирующего лейкоз (ЛИФ), обозначается знаком + или –. Приведено сравнение дней in vitro (DIV) и классических стадий развития (DS) для первичн...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Нокаут DMEM	Технологии Life	10829-018	Среда: Питательная среда ESC Формула и примечания: 500 мл
100x MEM NEAA	Технологии Life	11140-050	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца Рецептура и примечания: 6 мл
200 мМ L-аланил-L-глютамин	АТКС	30-2115 (Английский)	6 мл
Квалификация FBS для ES	Прикладные стволовые клетки	АСМ-5007	90 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	3 мл
55 мМ 2-меркаптоэтанол	Технологии Life	21985-023	1,1 мл
107 единиц/мл LIF	Многородность	ESG1107	60 μЛ
Нокаут DMEM	Технологии Life	10829-018	Среда: среда для дифференцировки ESC Формула и примечания: 436,6 мл
100x MEM NEAA	Технологии Life	11140-050	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца Состав и примечания: 5 мл
200 мМ L-аланил-L-глютамин	АТКС	30-2115 (Английский)	5 мл
Сыворотка, сертифицированная по стандарту ESC	Прикладные стволовые клетки	АСМ-5007	50 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	2,5 мл
55 мМ 2-меркаптоэтанол	Технологии Life	21985-023	0,9 мл
PBS Дульбекко	Сигма-Олдрич	Д8537	Среда: Среда для трипсинизации NPC Рецептура и примечания: 100 мл
0,5 млн ЭДТА (18,3%)	Сигма-Олдрич	No 3690	Среда: заморозить в 5 мл аликвоты Рецептура и примечания: 0,266 мл
трипсин	Сигма-Олдрич	Т8802	50 мг
Полиэтиленимин (ПЭИ)	Сигма-Олдрич	П3143	Среда: Растворы для поверхностных покрытий Рецептура и примечания: 2,5 мкг/мл в H20
Поли-D-лизин (PDL)	Сигма-Олдрич	П7280	Среда: использовать в течение 1 недели Формула и примечания: 100 мкг/мл в H20
Ламинин	Сигма-Олдрич	Л2020	5 мкг/мл в H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Технологии Life	10565-018	Среда: Питательная среда NPC Рецептура и примечания: 492,5 мл
100х витамины N2	Технологии Life	17502-048	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца Состав и примечания: 5 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	2,5 мл
Нейробазальный А	Технологии Life	10888-022	Среда: Питательная среда ESN Рецептура и примечания: 482,5 мл
50x витамины B27	Технологии Life	17504-044	Среда: хранить при температуре 4 °C до 1 месяца Состав и примечания: 10 мл
200 мМ L-аланил-L-глютамин	АТКС	30-2115 (Английский)	5 мл
100 антибиотиков	Сигма-Олдрич	А5955	2,5 мл
5-фтор-2'-дезоксиуридин (5FDU)	Сигма-Олдрич	Ф0503	Среда: 2000х Митотические ингибиторы аликвот и хранить при -20 °С Состав и примечания: дд 150 мг 5FDU и 350 мг уридина до 10 мл нейробазала А. Стерильный фильтр, аликвоту и заморозку. Используйте 2000x в питательной среде ESN.
Уридин	Сигма-Олдрич	У3003
ТрипLE Экспресс Трипсин	Технологии Life	12605-010	Носитель: Разное Состав и примечания: хранить в RT
Дмсо	Сигма-Олдрич	Д8418	магазин в RT
ингибитор трипсина сои (ИППП)	Сигма-Олдрич	Т6414	хранить при температуре -20 °C
этанол	Сигма-Олдрич	Е7023	магазин в RT
аскорбиновая кислота	Сигма-Олдрич	А4403	Приготовьте 100 мМ бульона, растворив 100 мг аскорбиновой кислоты в 5,7 мл смеси ДМСО/этанол 50:50.
ретиноевая кислота (РА)	Сигма-Олдрич	Р2625	Ресуспендируйте 15 мг РА в 9 мл 50:50 ДМСО/этанол. Добавьте 1 мл 100 мл аскорбиновой кислоты. Аликвот и хранить при -80 °C. Стабильно в течение 6 месяцев.
Плазменный очиститель	Гаррик Плазма	ПДК-32Г
Инвертированный микроскоп Olympus IX51	Олимп	Н/Д
Стеклянные покровные стекла 18 мм	рыбак	Тел.: 12-545-84
Сетчатый фильтр (40 μм)	рыбак	Тел.: 08-771-1
Шейкер для танцовщицы живота Stovall	рыбак	Тел.: 15-453-211
Тарелки с низкой адгезией	рыбак	Тел.: 05-539-101	Рог 3262
Бактериальные блюда	ВВР	25384-302 (Английский)	100 x 15 мм