1. Дифференцировка нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.1 - 1.5 до полудня и шаг 1.7 после полудня. Обзор процедур дифференцировки представлен на рисунке 1А.
- Перелейте 350 μл (3,5 x 106) ЭСК в 10-сантиметровую чашку с низким уровнем прикрепления, содержащую 25 мл дифференцировочной среды. Поместите в орбитальный шейкер с частотой вращения 30 - 45 об/мин в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C с 5%CO2. Это первый день дифференцировки, называемый днем in vitro (DIV) -8,< бр/>
заметка: Использование чашки со сверхнизкой присадкой увеличивает стоимость метода, но дает несколько больший выход, чем бактериальные чашки Петри, поскольку заполнители могут иногда прилипать к чашкам Петри. Если вы предпочитаете чашки разных размеров, средние объемы и количество ячеек могут быть масштабированы соответствующим образом.
- Через 48 часов (DIV -6) с помощью пипетки объемом 25 мл переведите дифференцирующие клеточные агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Сразу же добавьте в чашку Петри свежие 25 мл дифференцировочной среды.
- Дайте заполнителям осесть в течение 2 - 5 минут, образуя видимую гранулу глубиной 1 - 2 мм. Игнорируйте отдельные клетки или небольшие агрегаты, оставшиеся во взвешенном состоянии. Осторожно отсадите среду и перенесите клеточную гранулу обратно в чашку Петри с помощью P1000. Поместите на ротационный шейкер в инкубатор для культуры тканей.
- В DIV -4 повторите шаг 1.2. Гранула будет иметь глубину 2 - 4 мм. Замените 30 мл дифференцировочной среды с добавлением 6 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА) в чашку Петри. Вернитесь к ротационному встряхивателю в инкубаторе для культивирования тканей еще на 48 часов.
- В DIV -2 повторите шаг 1.3. На этом этапе гранула будет иметь глубину 4 - 8 мм.
- В DIV -1 подготовьте поверхности для гальванического покрытия, как указано в разделе 2.
- При DIV 0 разморозьте 5 мл предварительно аликвотированной и замороженной среды для трипсинизации NPC при 37 °C в течение 5 - 10 мин и поместите в колпак для культуры тканей. С помощью пипетки объемом 25 мл перенесите дифференцирующие агрегаты в коническую пробирку объемом 50 мл. Дайте заполнителям осесть и осторожно аспирируйте среду. Промойте гранулу дважды 10 мл PBS, дав заполнителям осесть между промывками.
- После второй промывки PBS добавьте в гранулу 5 мл среды для трипсинизации NPC и выдерживайте при 37 °C в течение 5 мин. Осторожно переверните пробирку через 2,5 мин.
- Добавьте 5 мл 0,1% ингибитора трипсина сои (ИППП) для инактивации трипсина и перемешайте путем инвертирования. Осторожно растирайте 10–15 раз серологической пипеткой объемом 10 мл до получения относительно однородной клеточной суспензии.
- Медленно перенесите клеточную суспензию в клеточный фильтр размером 40 мкм или 70 мкм, помещенный на верхнюю часть конической пробирки объемом 50 мл. После того, как вся суспензия будет отфильтрована, добавьте 1 мл среды N2, чтобы промыть оставшиеся клетки через фильтр, и гранулируйте диссоциированную клеточную суспензию в течение 6 минут при 200 х г.
- Отсаживайте среду, не нарушая гранулы. Дважды промойте ячейки средой N2 объемом 10 мл, гранулируя ячейки в течение 5 минут при плотности 200 x g и растирая между стирками с помощью P1000. Перед вторым промывкой подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Ресуспендируйте клетки в среде N2 со скоростью 1 x 107 клеток/мл и пластинчатыми ESN с плотностью клеток 150 000 - 200 000 клеток/см2.
- Перенесите только что нанесенные ЭСН в инкубатор для увлажненных культур тканей при температуре 37 °C и 5%CO2 и храните, как описано в разделе 3.
2. Подготовка поверхностей культуры для осаждения нейронных предшественников в DIV 0
- Готовьте блюда, обработанные тканевыми культурами, не менее чем за 1 день до сервировки. Добавьте достаточное количество полиэтиленимина (PEI; 25 мкг/мл в стерильном H2O) или поли-D-лизина (PDL; 100 мкг/мл в стерильном H2O) для покрытия пластиковой посуды, обработанной культурой тканей, и инкубируйте O/N при 37 °C.
- Утром в день сервировки дважды вымойте посуду двойным дистиллятором H2O и один раз PBS. После окончательного мытья добавьте достаточное количество N2 среды, чтобы покрыть посуду (например, 1 мл на лунку 12-луночной посуды или 4 мл на 6-сантиметровую посуду).
- Подготовьте стеклянные покровные стекла толщиной 18 мм не менее чем за сутки до нанесения нейронного покрытия. Очистите покровные стекла плазменной очисткой в течение 4 минут.
- Немедленно переложите очищенные покровные листы на промытую этанолом парапленку на дно большой стерильной посуды и добавьте 400 мкл раствора PEI или PDL, приготовленного как в пункте 2.1. Инкубируйте Н/Н при 37 °C в инкубаторе для культуры тканей.
- Утром промойте покровные стекла три раза водой и добавьте 5 мкг/мл ламинина в PBS на 1 - 3 часа при 37 °C. Перед диссоциацией нейронов аспирируйте ламинин и немедленно перенесите покровное стекло в лунку 12-луночной чашки, содержащей 1 мл среды NPC, обязательно держа обработанной стороной вверх.
- Храните посуду и покровные стекла при температуре 37 °C, пока NPC не будут готовы к подаче на тарелку.
3. Обслуживание нейронов
- В DIV 1 аспирируйте среду и замените ее питательной средой N2.
- В разделах 2 и 4 аспирируйте среду и замените питательной средой B27.
- В DIV 8 аспирируйте среду и замените ее культуральной средой B27, содержащей ингибиторы митоза, для устранения загрязняющих ненейрональных клеток.
- В DIV 12 замените на культуральную среду B27.
- Не удаляйте DIV 12+ ESN с 5%CO2 до тех пор, пока не будете готовы к использованию.
