Магнитное отделение шванновских клеток от седалищных нервов мыши

Аннотация

Источник: Blusch, A., et al., in vitro миелинизация периферических аксонов в кокультуре ганглиев дорсальных корешков крысы и шванновских клеток. J. Vis. Exp. (2023)

Это видео демонстрирует метод выделения шванновских клеток из нервных волокон седалищного нерва мыши.

Протокол

1. Шванновская клеточная культура

1. Покрытие для шванновской клеточной культуры
   1. Посуду для клеточной культуры покрыть в стерильных условиях. Нанесите 2 мл 0,01% поли-L-лизина (ФАПЧ) на две чашки для культуры тканей (ТС) диаметром 60 мм и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   2. Удалите ФАПЧ, вымойте посуду TC 2 раза дистиллированной водой и инкубируйте с 2 мл 1 мкг/^см2 ламинина в течение ночи при 4 °C. Вымойте посуду TC 2 раза с помощью aqua dest и дайте тарелкам высохнуть на воздухе.
2. Подготовка среды для шванновской клеточной культуры
   1. Приготовьте 50 мл шванновской клеточной среды, добавив 10% инактивированной при нагревании эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мкМ форсколин, 10 нМ нейрегулина и 50 мкг/мл гентамицина к модифицированной среде Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)/F-12 (с высоким содержанием глюкозы) в стерильных условиях.
   2. Приготовьте 70 мл среды L-15 Лейбовица с 50 мкг/мл гентамицина в стерильных условиях.
3. Ферментативное пищеварение седалищного нерва
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются в стерильных условиях.
   1. Приготовьте ферментативный раствор для расщепления, содержащий 0,25% диспазы II, 0,05% коллагеназы I типа и 50 мкг/мл гентамицина в 10 мл DMEM (с высоким содержанием глюкозы).
   2. Центрифугируйте пробирку при давлении 188 x g в течение 5 мин при 4 °C, удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 25 мл и перенесите гранулу с оставшейся средой L-15 Лейбовица в чашку для культуры тканей диаметром 60 мм с помощью пипетки объемом 1000 мл.
   3. Промойте пробирку объемом 50 мл с 10 мл ферментативного раствора для пищеварения и добавьте его в чашку, содержащую нервные волокна. Аккуратно распределите салфетку в чашке кончиком пипетки, чтобы максимально освободить доступную поверхность для пищеварения.
   4. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 в течение 18 ч и остановить разложение, добавив 10 мл 40% FCS в сбалансированный раствор соли Хэнкса, без Ca²⁺ и Mg²⁺ (HBSS).
4. Разделение ячеек
   1. Перенесите переваренные нервы в пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки и центрифуги при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл DMEM, содержащего 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. Затем повторно суспендируйте гранулу 20 раз, используя наконечник пипетки объемом 10 мл, 5 мл, 2 мл, 1 мл и 200 мкл.
   2. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр 100 мкм и центрифугируйте при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу 4 мл DMEM, содержащего 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина.
   3. Добавьте по 2 мл клеточной суспензии в каждую из двух чашек ТС 60 мм, покрытых ФАПЧ и ламинином, и инкубируйте при 37 °C и 5%_CO2. Оставьте пластины нетронутыми на 2 дня в инкубаторе, чтобы защитить клетки от механического воздействия и поддержать прилипание.
5. Дифференцировка шванновских клеток
   1. Через 2 дня удалите среду и тщательно промойте пластины 2 раза с DMEM (с высоким содержанием глюкозы), 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина. После этого добавьте 2 мл шванновской клеточной среды. Заменяйте шванновскую клеточную среду каждые 2-й день и наблюдайте за внешним видом и слиянием клеток с помощью микроскопа.
6. Трипсинизация клеток и магнитная сепарация
   1. Когда слияние клеток достигнет примерно 80% (6-12 дней культивирования), тщательно промойте планшеты 2x 3 мл DPBS и инкубируйте с 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА (предварительно подогретого до 37 °C) в течение 3 минут. Когда клетки отделяются от дна пластины, инактивировать расщепление добавлением 2 мл DMEM с 10% FCS и 50 мкг/мл гентамицина.
      заметка: Придерживайтесь времени трипсинизации строго 3 минуты, а затем продолжайте быстро.
   2. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл магнитного буфера для разделения клеток, содержащего DPBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 нМ ЭДТА. Соедините 10 μл клеточной суспензии с 10 μл трипанового синего и подсчитайте клетки с помощью камеры для окрашивания.
   3. Центрифугируйте клеточную суспензию при 188 x g в течение 10 мин при 4 °C и ресуспендируйте клеточную гранулу в 90 мкл магнитного буфера для разделения клеток на 1 x 10⁷ клеток. Добавьте 10 мкл микрогранул Thy-1 на 1 x 10⁷ клеток. Повторно суспендируйте раствор несколько раз и выдерживайте в течение 15 минут в темноте при температуре 8 °C.
   4. Добавьте 2 мл магнитного буфера для разделения клеток в суспензию клеток и центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл магнитного буфера для разделения клеток.
   5. Увлажните колонку для разделения магнитных клеток 1 мл буфера для разделения магнитных клеток. Поместите колонну для разделения магнитных ячеек в сепаратор магнитных ячеек. Приложите ячейки к колонне для разделения магнитных ячеек. Соберите проточный поток и центрифугируйте при 300 x g при 4 °C в течение 10 мин.<бр/> заметка: Фибробласты положительно отбираются и остаются в колонке, в то время как шванновские клетки проходят через колонку. Фибробласты могут быть собраны с помощью штампа (например, в качестве отрицательного контроля для протоколов окрашивания шванновскими клетками).
   6. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл среды для кокультуры. Подсчитайте ячейки после окрашивания трипановым синим и камерой для окрашивания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бычий сывороточный альбумин	Карл Рот, Карлсруэ, Германия	8076.4 Материал 8076.4
Сетчатый фильтр для клеток, 100 μМ	BD Bioscience, Гейдельберг, Германия	No 352360 (Английский
Центрифуга 5810-R	Eppendorf AG, Гамбург, Германия	5811000015
Инкубатор СО2 Герацелл	Heraeus Instruments, Ханау, Германия	51017865
Диспаза II	Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия	4942078001
Дистиллированная вода (система очистки воды)	Millipore, Мольсхайм, Франция	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия	31331093
DPBS (без ионов кальция и магния)	Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия	Д8537-6С500МЛ
ФТС	Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия	Ф7524	FCS должна быть исследована на шванновскую клеточную культуру
Гентамицин	Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия	5710064
HBSS (без ионов кальция и магния)	Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия	14170138
Ламинин	Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия	Л2020-1МГ
Мультистенд MACS	Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия	130042303
Микроножницы	Fine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия	15000-08
микроскоп	Мотик, Вецлар, Германия	Мотик BA 400
Предметное стекло микроскопа	VWR, Раднор, США	630-1985
Сепаратор MiniMACS	Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия	130091632
Столбцы MS	Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия	Тел.: 130-042-201
Счетная камера Нойбауэра	Ассистент, Эрланген, Германия	40441
Пипетки	Eppendorf AG, Гамбург, Германия	2231300004
Поли-L-лизин	Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия	П4707-50МЛ
Серологическая пипетка, 10 мл	Sarstedt, Нюмбрехт, Германия	861254025
Серологическая пипетка, 25 мл	Sarstedt, Нюмбрехт, Германия	861685001
Серологическая пипетка, 5 мл	Sarstedt, Нюмбрехт, Германия	861253001
Тарелка ТК 60, ячейка +	Sarstedt, Нюмбрехт, Германия	833901300
Микрогранулы Thy-1 (набор MACS)	Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия	Тел.: 130-094-523
Трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красный	Thermo Fisher Scientific, Шверте, Германия	No 25300-054
Коллагеназа I типа	Sigma Aldrich GmbH, Штайнхайм, Германия	Ок1639 г.
Водяная баня типа 1008	GFL, Бургведель, Германия	No 4285

) гг.