$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Приготовление раствора среза с высоким содержанием сахарозы и искусственной спинномозговой жидкости (АКСФ)
- Перед экспериментальным днем
- Приготовьте 1 л 10-кратного раствора для срезов с водой лабораторного класса типа 1, содержащей (в мМ): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (табл. 1). Чтобы предотвратить выпадение фосфата кальция, медленно перемешивайте химикаты в стакане, предварительно заполненном 800 мл H2O, постоянно помешивая магнитной мешалкой. Хранить раствор при температуре 4 °C или комнатной температуре (RT).
- В день эксперимента
- Приготовьте 1 л 1x ACSF с водой лабораторного качества типа 1, содержащей (в мм²): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,252PO4, 26 NaHCO3, 25 глюкозы (табл. 2). Используйте осмометр давления пара для проверки осмолярности в диапазоне 305–315 мОм (pH ~ 7,55–7,6).
заметка: Чтобы предотвратить выпадение фосфата кальция, медленно смешайте все твердые химикаты в стакане, предварительно заполненном 800 мл H2O, постоянно помешивая магнитной мешалкой. Добавьте MgSO4 и CaCl2 в самом конце, медленно капая в необходимом количестве из 1 М стоковых растворов.
- Непрерывно пузырьковый 1x раствор ACSF при RT с карбогеном до установки pH в диапазоне 7,3–7,4,<бр/>
заметка: Если pH немного слишком высок или слишком низок, будет достаточно небольших корректировок силы карбогенации. Если рН выше 7,45 при карбогенации, отрегулируйте его, добавив несколько капель 1 М раствора2PO4.
- Приготовьте 250 мл (на мозг) 1x раствора слайса с высоким содержанием сахарозы в стакане, содержащем 25 мл 10x раствора для слайсов и (в мМ): 252 сахарозы, 26 NaHCO3 и 10 глюкозы (табл. 3). Убедитесь, что осмолярность находится в пределах 320–325 мОсм (pH ~ 7,55–7,6).
- Пузырьковый раствор слайсов с высоким содержанием сахарозы в течение 10–15 минут с карбогеном, чтобы контролировать pH в диапазоне 7,3–7,4,<бр/>
заметка: Если pH выше 7,45 при карбогенации, отрегулируйте его, добавив несколько капель 1 М KH2PO4 раствора.
- Храните раствор для ломтиков с высоким содержанием сахарозы в течение 20–30 минут в ультраморозильной камере (-80 °C) до частичного замерзания.
2. Вскрытие и позиционирование мозга мыши
- Перенесите мозг в охлажденную 35-миллиметровую чашку для культивирования и удалите все волосы или частицы крови из ткани, аккуратно промыв мозг пипеткой Пастера, наполненной ACSF (кровь оказывает цитотоксическое действие на ткани мозга).
- Перенесите мозг с помощью шпателя на смоченную фильтровальную бумагу поверх охлажденной 90-миллиметровой чашки для культуры (рисунок 1A).
- С помощью лезвия разрежьте мозг пополам, разделив два полушария, и поместите оба полушария на только что вырезанную медиальную сторону.
- С помощью лезвия удалите дорсальную часть мозга (5–10%) из каждого полушария с параллельным разрезом до дорсальной вершины (рис. 1C) и поместите оба полушария на свежевырезанную сторону так, чтобы вентральная часть мозга была обращена вверх.
- Поместите каплю суперклея на пластину для образца и правильно распределите наконечником пипетки, чтобы учесть оба полушария.
- Используйте ремешок из фильтровальной бумаги, чтобы захватить одно полушарие с капиллярными силами, касаясь брюшной стороны ремешком из фильтровальной бумаги, тем самым не повреждая ткань.
- Используйте еще один ремешок из фильтровальной бумаги, чтобы осторожно наполовину высушить дорсальную сторону мозга, прежде чем расположить полушарие тыльной стороной вниз поверх клея на пластине для образца. Повторите ту же процедуру со вторым полушарием.
заметка: Полушария должны быть расположены в горизонтальном выравнивании зеркальным образом на вибратомной пластине, при этом ростральные стороны должны быть направлены наружу, а каудальные стороны обращены друг к другу (но не касаются) посередине. Медиальные стороны обоих полушарий должны быть направлены к лезвию вибратома, а боковые стороны — к экспериментатору (рис. 1D).
- Поместите пластину с образцом в камеру для нарезки и быстро, но осторожно, накройте ее ледяной слякотью с высоким содержанием сахарозы. Как только раствор коснется клея, он застынет и правильно приклеит полусферы к пластине образца.
- Убедитесь, что полусферы правильно покрыты раствором ломтиков с высоким содержанием сахарозы, и убедитесь, что раствор пузырчат с помощью карбогена.
заметка: Вся процедура рассечения должна быть выполнена как можно быстрее. Следите за тем, чтобы мозг не оставался без подачи кислорода в течение очень долгого времени. От обезглавливания до погружения мозга в слякоть с высоким содержанием сахарозы должно пройти всего 1–1,5 минуты. Это самое важное требование к препаратам для острого среза мозга, чтобы гарантировать высокое качество среза.
3. Горизонтальный срез мозга
- Расположите вибратомное лезвие перед медиальной стороной полусфер и опустите его на ту же высоту, что и вентральные стороны полусфер, которые теперь обращены вверх. Опустите лезвие с помощью вибратомного регулятора на 600 мкм дальше в дорсальном направлении и начните нарезку. Лезвие должно ударяться о ткань (если нет, переверните лезвие и опустите его еще немного). Нарезайте до тех пор, пока первые два ломтика полностью не отделятся от двух полушарий.
- Переверните лезвие, опустите еще на 300 μм и снова нарежьте.
- Когда гиппокамп станет видимым (при необходимости используйте атлас мозга мыши) (рис. 1E) Соберите срезы с помощью расширенной пластиковой пипетки Пастера. Собирайте ломтики до тех пор, пока рядом с гиппокампом не станет виден хвостатый путамен. Как правило, для мозга мыши можно собрать от 8 до 12 срезов по 300 мкм (по 4–6 на каждое полушарие).
- С помощью пластиковой пипетки Пастера соберите ломтики и перенесите их в камеру восстановления на водяной бане (рис. 1F) (собирайте ломтики после каждого раунда нарезки, чтобы они не плавали в камере для срезов).
заметка: Работайте как можно быстрее и убедитесь, что раствор среза с высоким содержанием сахарозы охлажден и карбогенирован в течение всей процедуры. При необходимости наполните лед вокруг камеры для слайсов.
4. Восстановление срезов мозга для электрофизиологических записей
- Оставьте ломтики в камере восстановления, заполненной ACSF, на водяной бане при температуре 32 °C на 1 ч.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры для регенерации также доступны в продаже.
- Выньте восстановительную камеру из водяной бани.
- Поместите ломтики в режим RT еще как минимум на 30 минут для восстановления, прежде чем начинать дальнейшее применение.
Буферные и медиа-рецепты.
Таблица 1: 10 x предварительный раствор для ломтиков (1 л).
См.
Сталь
См.
мм
Сталь
См.
| соединение | Концентрация (мМ) | Молекулярная масса (г/моль) | Сумма (г) |
| KCl | 25 | 74.55 | 1.86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | 2.94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246,48 | 2.46 |
| КХ2ГО4 | 12,5 | 136,08 | 1.7 |
Таблица 2: 1x ACSF (1 L) (осмолярность между 305–315 мОсм).
мм
См.
См.
Сталь
Сталь
См.
См.
| соединение | Концентрация (мМ) | Молекулярная масса (г/моль) | Сумма (г) |
| NaCl | 125 | 58,44 | 7.3 |
| KCl | 2.5 | 74.55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | 2 | от 1 М раствора CaCl2 | 2 мл |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | из 1 М раствора MgSO4 | 1 мл |
| 2PO4 * 2H2O | 1.25 | 156.02 | 0,2 |
| НаОГС3 | 26 | 84.01 | 2.18 |
| Глюкоза * Н2О | 25 | 198,17 | 4.95 |
Таблица 3: 1x раствор среза с высоким содержанием сахарозы (250 мл) (осмолярность между 320–325 мОсм).
См.
мм
Сталь
См.
| соединение | Концентрация (мМ) | Молекулярная масса (г/моль) | Сумма (г) |
| 10-кратное разрешение среза | Н/Д | Н/Д | 25 мл |
| сахароза | 252 | 342.3 | 21,57 |
| НаОГС3 | 26 | 84.01 | 0,55 |
| Глюкоза * Н2О | 10 | 198,17 | 0,49 |
