Генерация наклоненных срезов миндалевидного тела из мозга мыши

Аннотация

Источник: Bosch, D., et al. ex vivo оптогенетическое препарирование цепей страха в срезах мозга. J. Vis. Exp. (2016)

Видео демонстрирует генерацию наклоненных срезов миндалевидного тела из мозга мыши. Мозг располагают под углом на стадии образца вибратома для получения срезов, содержащих миндалевидное тело и аксоны медиальной префронтальной коры, которые образуют синаптические связи с миндалевидным телом. Срезы мозга поддерживаются при физиологической температуре, чтобы сохранить ткань для дальнейших экспериментов.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Приготовление острых ломтиков

1. Приготовьте искусственную спинномозговую жидкость (АКСФ), режущий раствор, инструменты (ножницы, скальпель, щипцы, шпатель, пипетку Пастера) и агаровые блоки.<бр/> Примечание: 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) требуется для одного эксперимента и готовится путем растворения химических веществ в дважды дистиллированной H₂O, как было опубликовано ранее. Режущий раствор готовят путем дополнения 200 мл ACSF 0,87 мл 2 М MgSO₄ стокового раствора.
2. Окислите кислородом ACSF и режущий раствор на протяжении всего эксперимента с 95%_O2 и 5%_CO2.
3. Глубоко обезболить мышей с помощью аппарата для анестезии мелких животных с использованием изофлурана (3% кислорода). Прежде чем продолжить, проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса отведения конечностей.
4. Обезглавьте мышь с помощью больших ножниц и сразу охладите голову в ледяном растворе.
5. Откройте череп одним разрезом по средней линии от каудального до рострального и аккуратно отодвигайте кусочки черепа в стороны с помощью щипцов. Быстро удалите мозг, аккуратно приподняв его из черепа с помощью небольшого закругленного шпателя. Срежьте мозжечок скальпелем. Поместите мозг в ледяной раствор для резки.
6. Для медиальной префронтальной коры или мест инъекций mPFC: отрезать переднюю часть мозга (содержащую mPFC) с помощью скальпеля и поместить в ледяной раствор для резки до разрезания.
7. Удалите излишки режущего раствора с помощью фильтровальной бумаги и приклейте заднюю часть мозга к вибратомной стадии.
8. Для наклоненных срезов миндалевидного тела приклейте мозг на агаровый блок (4%), разрезанный под углом 35° (Рисунок 1D, посередине). Для срезов корональной миндалины, медиального коленчатого ядра / заднего интраламинарного ядра таламуса (MGm/PIN) и мест инъекции mPFC склеивайте мозг непосредственно на сцене (рис. 1D, слева и справа). Поместите дополнительный блок агара за мозг для устойчивости во время нарезки.
9. Поместите столик в камеру резки с ледяным кислородным раствором для резки, который поддерживается на уровне 4 °C с помощью охлаждающего устройства. Подготовьте острые срезы миндалевидного тела (320 мкм) с помощью сапфирового лезвия. Поместите ломтики в интерфейсную камеру, снабженную кислородом ACSF при комнатной температуре (RT).
10. После приготовления острых срезов миндалевидного тела поместите камеру на водяную баню при температуре 36 °C для восстановления срезов на 35 - 45 минут. Впоследствии верните камеру сопряжения в режим RT.
11. В начале шага 1.10 разрежьте срезы мест инъекций, как описано ранее для острых срезов миндалевидного тела (шаги 1.8 - 1.9). Восстановление срезов на водяной бане здесь не требуется. необязательный: Чтобы быстро оценить расположение места инъекции, наблюдайте за срезами на стереоскопе, оснащенном люминесцентной лампой и соответствующими наборами фильтров.

Результаты

Рисунок 1. Стереотаксические инъекции, подготовка острых срезов мозга и визуализация пресинаптических волокон.(А, Б) Стереотаксическая инъекция вируса. А) Изображение мыши, находящейся под наркозом, помещенной в стереотаксическую рамку с обнаженным черепом и пипеткой для инъекций. Вставка: Увеличьте изображение инъекционной пипетки, наполненной вирусным раствором, смешанным с быстрым...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
искусственная спинномозговая жидкость (АКФБ)
Внутренние решения для исправлений
Гептагидрат сульфата магния	Рот, Германия	Р027.1	приготовить исходный раствор 2М в очищенной воде
Слайсер, Microm HM650V	Fisher Scientific, Германия	920120
Блок охлаждения для слайсера для салфеток, CU65	Fisher Scientific, Германия	770180
Сапфировое лезвие	Делавэрские алмазные ножи		Индивидуальный заказ, запрос в компании
Стереоскоп, SZX2-RFA16	Олимп, Япония
Патч-микроскоп, BX51WI	Олимп, Япония
Регулятор температуры ванны, TC05	Luigs & Neumann, Германия	200-100 500 0145
Фильтровальная бумага из нитрата целлюлозы для интерфейсной камеры	Satorius Stedim Biotech, Германия	13006--50 АКН