Создание коронального среза мозга, обнажающего области миндалевидного тела из мозга мыши

Abstract

Источник: Bosch, D., et al. ex vivo оптогенетическое препарирование цепей страха в срезах мозга. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует приготовление тонких корональных срезов мозга мыши, обнажая области миндалевидного тела, богатые синаптическими связями медиальной префронтальной коры. Затем срезы восстанавливаются в насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкости для поддержания жизнеспособности нейронов.

Protocol

1. Приготовление острых ломтиков

1. Приготовьте ACSF, режущий раствор, инструменты (ножницы, скальпель, щипцы, шпатель, пипетку Пастера) и агаровые блоки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На один эксперимент требуется 1 л искусственной спинномозговой жидкости (АКФБ). Как было опубликовано ранее, ACSF получают путем растворения химических веществ в двойной дистилляции H2O. Режущий раствор готовят путем дополнения 200 мл ACSF 0,87 мл 2 М MgSO₄ стокового раствора.
2. Окислите кислородом ACSF и режущий раствор на протяжении всего эксперимента с 95%_O2 и 5%_CO2.
3. Глубоко обезболите мышь с помощью наркозного аппарата для мелких животных, используя изофлуран (3% кислорода). Прежде чем продолжить, проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса отведения конечности.
4. Обезглавьте мышь с помощью больших ножниц и сразу же охладите голову в ледяном растворе для резки.
5. Вскрыть череп одним разрезом по средней линии от каудального до рострального и аккуратно раздвинуть части черепа в стороны с помощью щипцов. Быстро удалите мозг, аккуратно приподняв его из черепа с помощью небольшого закругленного шпателя. Срежьте мозжечок скальпелем. Поместите мозг в ледяной раствор для резки.
6. Для мест инъекций mPFC используйте скальпель, чтобы отрезать переднюю часть мозга (содержащую mPFC) и поместить ее в ледяной раствор для резки до разрезания.
7. Удалите излишки режущего раствора с помощью фильтровальной бумаги и приклейте заднюю часть мозга к вибратомной стадии.
8. Для срезов корональной миндалины, мест инъекций MGm/PIN и инъекций mPFC склейте мозг непосредственно на сцене (рис. 1D, слева и справа). Поместите дополнительный блок агара позади мозга для устойчивости во время нарезки.
9. Поместите столик в камеру резки с ледяным кислородным раствором для резки, поддерживаемым при температуре 4 °C с помощью охлаждающего устройства. С помощью сапфирового лезвия подготовьте корональные срезы миндалевидного тела. Поместите срезы в интерфейсную камеру, снабженную кислородосодержащим ACSF на RT.

Results

Рисунок 1. Стереотаксические инъекции, подготовка острых срезов мозга и визуализация пресинаптических волокон. (А, Б) Стереотаксическая инъекция вируса. А) Изображение мыши, находящейся под наркозом, помещенной в стереотаксическую рамку с обнаженным черепом и пипеткой для инъекций. Вставка: Увеличьте изображение инъекционной пипетки, наполненной вирусным раствором, смешанным с быстры...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Искусственная спинномозговая жидкость (АКШФ)	Композицию см. в ссылках #16 и #23
Решения для внутренних патчей	Композицию см. в ссылках #16 и #23
Слайсер, Microm HM650V	Fisher Scientific, Германия	920120
Блок охлаждения для слайсера для салфеток, CU65	Fisher Scientific, Германия	770180
Сапфировое лезвие	Делавэрские алмазные ножи
Стереоскоп, SZX2-RFA16	Олимп, Япония