Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB
1. Вскрытие ДГ (Время: 15 мин)
- Приготовьте среды для выделения ядер 1 и 2 (NIM1 и NIM2), гомогенизационный буфер (HB) и промывочные среды (WM) (табл. 1). Поместите все буферы, среды, реагенты и инструменты на лед до тех пор, пока они не понадобятся. Поместите гомогенизатор Dounce (см. Таблицу материалов) на лед во время приготовления (минимум за 1 час до этапа гомогенизации).
заметка: NIM1 можно готовить и хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев. NIM2, HB и WM должны быть свежеприготовленными.
осторожность: Осторожно манипулируйте дитиотреитолом (DTT), ингибитором протеазы, и Triton X-100. Эти соединения раздражают кожу и глаза, остро токсичны и опасны для водной среды. При использовании этих химикатов надевайте защитные перчатки, одежду, средства защиты глаз и лица, тщательно мойте руки после работы и избегайте попадания в окружающую среду.
- Усыпить 22-месячного самца мыши C57Bl/6J при вывихе шейки матки в соответствии с процедурой Приложения 1 Министерства внутренних дел.
заметка: Смотрите обсуждение обоснования использования 22-месячной мыши в этом исследовании. Тем не менее, этот протокол может быть выполнен в любом возрасте на протяжении всей жизни.
- Препарируйте мозг усыпленной мыши и перенесите его в 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную ледяным 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) (Рисунок 1). Поставьте чашку Петри на лед. Удалите мозжечок с помощью скальпеля и разрежьте мозг пополам между обоими полушариями (по сагиттальной оси).
- Наполните новую 10-сантиметровую чашку Петри ледяным PBS и поставьте ее на лед. Перенесите одну половину мозга в новую чашку Петри. С помощью бинокля расчлените ДГ и повторите этот шаг, чтобы получить вторую ДГ из второго полушария мозга.
заметка: Эти шаги (шаги 1.2-1.4) были адаптированы из ранее описанной процедуры. На этом этапе важно действовать как можно быстрее, чтобы сохранить целостность клеток.
- Переложите два DG в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce и добавьте 1 мл холодного HB.
2. Диссоциация тканей, выделение одиночных ядер и иммуноокрашивание против NeuN (Время: 2 часа)
- Гомогенизируйте ткань 10 ударами рыхлого пестика «А», а затем 15 ударами плотного пестика «В».
заметка: Гомогенизацию Dounce следует выполнять с помощью раствора на льду легкими движениями для снижения нагрева, вызванного трением и пенообразованием. Все буферы и оборудование должны быть предварительно охлаждены и находиться на льду во время процедуры.
- Перелейте гомогенат в предварительно охлажденную пробирку объемом 15 мл; промойте гомогенизатор Dounce 1 мл холодного HB и соедините в той же пробирке. Добавьте 3 мл HB в 15 мл пробирки и инкубируйте 5 минут на льду. Перемешайте 2 раза, осторожно перевернув трубку.
- Предварительно намочите крышку ситечка 70 мкм 0,5 мл HB над пробиркой объемом 50 мл. Процедите суспензию ядер из шага 2.2, осторожно опрокинув пробирку объемом 15 мл в клеточный фильтр. Промойте сетчатое фильтр 0,5 мл HB.
- Снимите сетчатое фильтр и центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g в течение 5 минут при температуре 4 °C с помощью центрифуги с качающимся ведром. Выбросьте надосадочную жидкость.
заметка: Процеживание гомогената поможет уменьшить количество мусора, что имеет решающее значение для проточной цитометрии и секвенирования одноядерных РНК (snRNA-seq) на последующих этапах.
- Осторожно суспендируйте гранулу в 4 мл HB с помощью пипетки P1000. Выдерживать на льду в течение 5 минут. Отжимайте при 500 x g в течение 10 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл WM.
- Предварительно смочите крышку ситечка 35 мкм над пробиркой объемом 15 мл 0,5 мл WM. Процедите суспензию ядер с шага 2,5 через клеточный фильтр, осторожно пипетируя по 0,5 мл за раз с помощью пипетки P1000.
- Промойте крышку фильтра 0,5 мл WM и положите тюбик на лед. Перенесите фильтрат в новую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут и 4 °C при 500 x g. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл WM.
- Вращайте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл WM с мышиным антинейрональным ядерным антигеном (NeuN), конъюгированным антителом AlexaFluor 488 (анти-NeuN-AF488, 1:32,000) и 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Выдерживать в течение 45 минут на льду в темноте.
заметка: Для оптимизации иммуноокрашивания выделенных ядер рекомендуется титровать антитело для определения оптимального разведения для анализа и сортировки проточной цитометрии. Затем запустите соответствующие меры контроля, чтобы убедиться, что условия окрашивания являются оптимальными. Например, при использовании конъюгированного антитела к NeuN-AF488 для оценки сегрегации неокрашенных и окрашенных популяций проводили отрицательный контроль (т.е. без добавления антитела, рис. 2А) и положительный контроль (т.е. окрашивание антителом, рис. 2В). При начале работы с AF488-конъюгированным антителом рекомендуется провести контроль изотипа AF488 для оценки специфичности. Если используется неконъюгированное антитело, может потребоваться дополнительный контроль, такой как добавление вторичного антитела только к ядрам препарата, для оценки неспецифического связывания вторичного антитела.
3. Флуоресцентно-активируемая сортировка ядер (FANS) для исключения популяций нейронов (Время: 45 мин)
- Перенесите суспензию иммуноокрашенных ядер в пробирку объемом 5 мл и держите ее на льду до начала процедуры проточной цитометрии.
заметка: При работе с более крупными частями ткани, чем два ДГ мыши, может потребоваться дальнейшее разведение с помощью буфера WM, чтобы избежать засорения сортировщика клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), если плотность ядер в растворе становится высокой.
- Перед помещением трубок в прибор FACS в течение 3 с низкой скоростью необходимо провести вихревую обработку образцов (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: (Настройка FACS) Сортировочные машины должны быть выровнены в начале процедуры с калибровочными частицами в соответствии с рекомендациями производителя. Задержка капли калибровалась с помощью шариков или микросфер (см. Таблицу материалов) в соответствии с моделью FACS. Образцы сортировали при 4 °С в режиме чистоты. Для уменьшения объема сбора ядра сортировали через сопло 70 мкм при рекомендованном давлении для проточного цитометра. Ядра сортировали в пробирки с низким связыванием объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов), содержащие 50 мкл WM. Все пробирки для сбора были покрыты PBS + 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) при 4 °C в течение ночи для снижения риска прилипания ядер к стенкам пробирки.
- Чтобы получить данные из образца окрашенной суспензии ядер, установите ворота в DAPI-height и DAPI-area с целью исключения клеточного мусора и агрегированных ядер (рис. 3A). Кроме того, отделите отдельные ядра от любых оставшихся DAPI-окрашенных агрегатов или клеточного мусора, установив затворы в области логарифмического бокового рассеяния (SSC) и области логарифмического прямого рассеяния (FSC) (рис. 3B).
- Установите вентили для анти-NeuN-AF488 и FSC-зоны, чтобы изолировать NeuN-AF488-отрицательную популяцию, как показано на рисунке 3C.
- После анализа, используя описанную выше стратегию гейтирования, отсортируйте NeuN-AF488-отрицательную популяцию в пробирке для сбора объемом 1,5 мл, заполненной 50 мкл WM.
заметка: В соответствии с описанной выше стратегией гейтирования и процедурой вскрытия для выделения DG из мозга взрослой мыши, ожидается, что NeuN-AF488-отрицательная популяция будет составлять ~14% одиночных ядер.
Таблица 1: Составы сред и буферов, использованных в исследовании.
См.
См.
См.
См.
| Среда для выделения ядер #1 (NIM1) – хранить до 6 месяцев при 4 °C |
| компонент | Объем (μл) | Конечная концентрация (мМ) |
| 1,5 м сахароза | 1 833,30 | 250 |
| 1 м KCl | 275 | 25 |
| 1 М MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 М Трис буфер, pH 8,0 | 110 | 10 |
| Вода без нуклеаз | 8 726,70 | - T |
| Общий объем | 11 000 | - T |
| Среда для выделения ядер #2 (NIM2) – сделать свежее |
| компонент | Объем (μл) | Конечная концентрация |
| NIM1 | 10 769 | - T |
| 1 мМ DTT | 11 | 1 мкМ |
| 100х ингибитор протеазы | 110 | 1x |
| Triton X-100 10% (v/v) | 110 | 0,1% (v/v) |
| Общий объем | 11 000 | - T |
| Гомогенизационный буфер (HB) – готовьте свежие |
| компонент | Объем (μл) | Конечная концентрация |
| NIM2 | 10 958,75 | - T |
| Ингибитор РНКазы, 40 Ед μL-1 | 27.5 | 100 U мл-1 |
| РНКазин, 40 Ед μл-1 | 13.75 | 50 Ед мл-1 |
| Общий объем | 11 000 | - T |
| Wash Media (WM) |
| компонент | Объем (μл) | Конечная концентрация |
| BSA 7,5% | 1 466,70 | 1% |
| Ингибитор РНКазы, 40 Ед μL-1 | 27.5 | 100 U мл-1 |
| РНКазин, 40 Ед μл-1 | 13.75 | 50 Ед мл-1 |
| ПБС | 9 492,05 | - T |
| Общий объем | 11 000 | - T |
