Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Материалы
- Перед началом протокола приготовьте следующие растворы:
- Приготовьте загрузочный буфер, добавив фетальную бычью сыворотку (FBS, 2%) в фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Добавьте нейтральный красный (NR) краситель (последний 1%) в PBS.
- Приготовьте следующие растворы с помощью имеющегося в продаже набора для диссоциации мозга у взрослых (см. Таблицу материалов).
- Для приготовления ферментной смеси 1 пипетку пипетку 1,9 мл буфера Z и 50 мкл фермента P в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Для приготовления ферментной смеси 2 пипеткой наберите 20 мкл буфера Y и 10 мкл фермента A в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Приготовьте раствор для удаления мусора.
2. Перфузия и диссекция мышей
- Внутрибрюшинно (в/в) ввести мышке 500 мкл 1% NR красителя в PBS за 2-3 ч до анестезии.
заметка: Внутрибрюшинное введение NR в демиелинизирующих мышиных моделях помогает различить поражения (Рисунок 1).
- Обезболите мышь пентобарбиталом (50 мг/кг, внутримышечно) и убедитесь, что мышь успешно обезболивается, исследуя болевые реакции.
- Вскройте грудную полость мыши и обнажите сердце.
- Аккуратно отрежьте небольшой уголок правого предсердия и внутрисердечно перфузируйте мышь 20-30 мл холодного PBS из левого желудочка.
- Обезглавьте мышь под наркозом.
- Откройте череп мыши и осторожно освободите мозг от черепа.
- Перенесите мозг в форму для среза мозга мыши и разрежьте мозг на ломтики по 0,1 см.
- Удалите срезы мозга и поместите их в холодную PBS в чашке Петри (60/15 мм). С помощью микрохирургических щипцов микрорассекают поражения, помеченные NR красителем, вокруг мозолистого тела под стереомикроскопом.
заметка: Убедитесь, что рассеченная ткань является как можно более полной, чтобы облегчить последующий перенос; Общий прогресс вскрытия должен быть завершен за 2 часа.
- Перенесите рассеченную ткань в центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие соответствующее количество буфера для холодной загрузки.
заметка: Соберите ткань мозолистого тела 2-3 мышей в одну пробирку в качестве одного образца.
3. Диссоциация тканей
- Центрифугируйте рассеченную ткань при давлении 300 ×g в течение 30 с (после достижения этой скорости), чтобы собрать образец на дне пробирки.
- Разогрейте смесь ферментов от 1 и 2 до 37 °C в инкубаторе.
- Добавьте 1 950 мкл предварительно подогретой смеси ферментов 1 к одному образцу и переварите в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 5 минут.
- Добавьте 30 μл предварительно подогретой смеси ферментов 2 и аккуратно перемешайте.
- Варить в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 15 минут и аккуратно перемешивать каждые 5 минут.
- Добавьте в пробирку 4 мл холодного PBS после переваривания и осторожно встряхните.
- Поместите фильтры 70 μм на центрифужные пробирки объемом 50 мл и предварительно смочите фильтры 500 μЛ холодной PBS. Отфильтруйте диссоциированную ткань, пропустив переваренные образцы тканей через фильтры, и перенесите отфильтрованную суспензию из центрифужной пробирки объемом 50 мл в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
заметка: Пропустите этот шаг, если количество ткани слишком мало.
- Отфильтрованные образцы тканей центрифугируют при давлении 300 ×g в течение 10 мин при 4 °C и медленно и полностью отсасывают надосадочную жидкость><.
заметка: Все этапы следует выполнять на льду, за исключением ферментативного пищеварения.
4. Удаление мусора
- Осторожно суспендируйте клеточную гранулу с помощью 1 550 μл холодного PBS.
- Добавьте 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и хорошо перемешайте.
- Медленно и осторожно нанесите на вышеуказанную смесь 2 x 1 мл холодного PBS с помощью пипетки объемом 1 000 μл.
заметка: Наклоните пробирку центрифуги на 45° и медленно добавьте PBS вдоль стенки трубки с помощью пипетки.
- Медленно и осторожно перенесите пробирку в центрифугу и вращайте при 4 °C и 3 000 × г в течение 10 минут.
- После центрифугирования ищите три слоя. Полностью отасуньте два верхних слоя с помощью пипетки объемом 1 000 мкл (Рисунок 2).
- Наполните пробирку объемом до 5 мл буфером для холодной загрузки и аккуратно переверните пробирку три раза.
- Центрифугируйте при 4 °C и 1 000 × г в течение 10 мин. Полностью отасуньте надосадочную жидкость и избегайте разрушения клеточной гранулы.
5. Магнитное разделение клеток микроглии
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу с 90 μл загрузочного буфера и добавьте 10 μL гранул CD11b (Microglia).
- Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 15 минут при температуре 4 °C.
- Добавьте 1 мл загрузочного буфера и аккуратно пипетируйте жидкость вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 000 мкл, чтобы промыть клетки после инкубации. Центрифугируйте клетки при температуре 4 °C и 300 × г в течение 10 минут и полностью аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанные шарики.
- Ресуспендируйте элементы в 500 мкл загрузочного буфера.
- Поместите колонку МС с ее разделителем для положительного отбора в магнитном поле.
- Промойте колонку 500 μл загрузочного буфера для защиты ячеек и обеспечения эффективности магнитной сортировки, следуя протоколу производителя.
- Нанесите клеточную суспензию на столбец MS и отбросьте проточный поток, содержащий непомеченные клетки.
- Добавьте 500 μL загрузочного буфера в колонку три раза, чтобы смыть ячейки, которые прилипают к стенке колонны, и отбросить проточный поток.
заметка: Добавляйте новый буфер загрузки для промывки только в том случае, если резервуар колонны пуст.
- После промывки колонки снимите колонку с сепаратора и поместите ее на центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте 1 мл загрузочного буфера в колонку и нажмите на поршень на дно, чтобы промыть ячейки с магнитной маркировкой. Повторите этот шаг три раза, чтобы полностью собрать магнитно помеченные клетки.
