Клеточная судьба перепрограммирования половых клеток нематоды в нейроны

Аннотация

Источник: Kolundzic, E., et al. Применение РНК-интерференции и экспрессии транскрипционного фактора, индуцированного тепловым шоком, для перепрограммирования зародышевых клеток в нейроны у C. elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует перепрограммирование зародышевых клеток нематоды в нейроны. Трансгенные личинки нематоды Caenorhabditis elegans подвергаются РНК-интерференции (РНК-интерференции) для подавления специфического хроматин-регулирующего фактора, что делает половые клетки их потомства более восприимчивыми к перепрограммированию клеточной судьбы. Тепловой шок применяется к потомству, заставляя половые клетки экспрессировать нейрон-специфичный фактор транскрипции, который запускает их трансформацию в нейроны, которая идентифицируется с помощью экспрессированного флуоресцентного репортера.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Приготовление раствора

1. Пластины NGM-Agar (1 л)
   1. Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептоновой среды (например, Bacto-Peptone) и 20 г агара. После автоклавирования добавьте 1 мл холестерина (5 мг/мл в запасе 95% этанола [EtOH]), 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 1 М CaCl₂, 25 мл 1 М К₂PO₄ и 1 мл амфотерицина B (2,5 мг/мл запаса).
2. Пластины NGM-Agar RNAi (1 л)

Результаты

Рисунок 1: фенотип pvul, вызванный РНК-интерференцией против lin-53. (Вверху) Дифференциально-интерференционная контрастная картина (ДВС) потомства L4/молодых взрослых червей стадии F1, полученных от матерей контрольной группы или матерей, получавших РНК-интерференцию lin-53. Масштабные линейки = 20 мкм. (внизу) Животные, обработанные лин-53 РНК-интерференцией, демонстрирую.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
химикалии
Агар-Агар, Кобе I	Рот	5210.1
Бактопептон	А. Хартенштайн ГмбХ	Телефон: 211 677	Пептоновые среды
Дрожжевой экстракт	АпплиХим	А1552,0100
Амфотерицин В	USBиология	А2220
CaCl2	Merck Biosciences	No 208290
холестерин	Рот	8866.2
желатин	Рот	4275.3 Кабельный номер 4275.3
ИПТГ	сигма	15502-10Г
К2ПК4	Рот	Т875.2
КХ2ГО4	Рот	3904.2
MgSO4	ВВР	2,51,63,364
Na2HPO4	Рот	П030.1
NaCl	Рот	9265.1 Телефон 9265.1
NaClO	Рот	9062.3
NaOH (5 N)	Рот	КК71.1
Трис	Рот	АЕ15.2
Карбенициллин	Рот	634412
Тетрациклин	Рот	2371.2 Материал 2371.2
Инкубаторы
инкубатор	Нью-Брансуик Сайентифик С24	М1247-0052	для теплового шока
инкубатор	Саньо МИР-5	5534210	для поддержания штаммов червей при температуре 15 °C или 25 °C
Микроскопы
Флуоресцентный микроскоп	М205 ФА	Лейка
Микроскоп (Визуализация) + камера	Сканер Axio Imager 2	Цейсс
Микроскоп (Визуализация) + камера	Сенсикам	БПКЯ
Стереомикроскоп	СМЗ745	Компания Nikon
Штаммы бактерий
Кишечная палочка HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 лизоген: промотор lavUV5 -Т7-полимераза) (IPTG-индуцируемая Т7 полимераза) (РНКаза III минус).
Кишечная палочка OP50			Штамм Uracil auxotroph E. coli
Штаммы червей
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			получен от OH9846 в 4 раза больше обратного скрещивания с N2
Клоны РНК-интерференции
ЛИН-53	ИсточникБионаука	Идентификационный номер I-4D14	Библиотека Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
пустой ветор: L4440	Адджен	#1654
Разное.
Червячная кирка			Самостоятельно с помощью пастеровской пипетки и платиновой проволоки

Кабель Кабель Кабель