Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление раствора
- Пластины NGM-Agar (1 л)
- Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептоновой среды (например, Bacto-Peptone) и 20 г агара. После автоклавирования добавьте 1 мл холестерина (5 мг/мл в запасе 95% этанола [EtOH]), 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 1 М CaCl2, 25 мл 1 М К2PO4 и 1 мл амфотерицина B (2,5 мг/мл запаса).
- Пластины NGM-Agar RNAi (1 л)
- Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептоновой среды и 20 г агара. После автоклавирования добавьте 1 мл холестерина (5 мг/мл в 95% запасе EtOH), 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 1 М CaCl2, 25 мл 1 М К2PO4, 1 мл амфотерицина B (2,5 мг/мл запаса), 1 мл 1 М изопропил β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и 1 мл карбенициллина (50 мг/мл).
- Лурия-Бертани (LB)-Агар (1 л)
- Добавьте 10 г пептонной среды, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 20 г агара, 10 мл 1 М Tris pH 8,0. Добавьте H2O в 1 л. После автоклавирования добавьте 1 мл карбенициллина 50 мг/мл и 2,5 мл тетрациклина 5 мг/мл.
- LB средний (1 л)
- Добавьте 10 г пептоновой среды, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl и 10 мл 1 M Tris pH 8,0. Добавьте H2O в 1 л. После автоклавирования добавьте 1 мл карбенициллина 50 мг/мл.
- M9-буфер (1 л)
- Добавьте 6,0 г Na2HPO4, 3 г K2PO4, 5 г NaCl и 50 мг желатина. Перед применением добавьте 1 мл 1 М MgSO4.
- Отбеливающий раствор (10 мл)
- Добавьте 1 мл NaClO и 2 мл 5 N NaOH. Добавьте H2O до 10 мл.
2. Получение пластин РНК-интерференции
Примечание: C. elegans обычно культивируется в лаборатории на 6-сантиметровых пластинах Петри, содержащих 7,5 мл агара среды роста нематод (NGM-Agar). Этот протокол оптимизирован для червей, содержащихся при температуре 15 °C. Для приготовления планшетов с НГМ используют стандартные стерильные методики, предотвращающие грибковое и бактериальное заражение. Ниже приведен протокол подготовки планшетов NGM с добавлением реагентов на РНК-интерференцию.
- Приготовьте 6-см РНК-интерференцированные пластины NGM-Agar, содержащие 1 мМ IPTG и 50 мкг/мл карбенициллина. Дайте им высохнуть в течение 24 – 48 часов при комнатной температуре в темноте.
- Храните РНК-интерференционные пластины при температуре 4 °C в темноте. Не используйте, если они старше 14 дней.
- Выберите клон РНК-интерференционной бактерии (Escherichia coli HT115), содержащий плазмиду L4440 с последовательностью ДНК гена lin-53, из замороженного глицеринового запаса из доступной библиотеки РНКи13 на пластинах LB-агара, содержащих 50 мкг/мл карбенициллина и 12,5 мкг/мл тетрациклина, используя трехфазную схему полос. Выращивайте бактерии при температуре 37 °C в течение ночи. Этот клон позволяет IPTG-зависимой продукции lin-53 дцРНК в бактериях.
- Кроме того, выращивайте РНК-интерференционные бактерии, которые содержат плазмиду L4440 без какой-либо последовательности генов в качестве пустого векторного контроля.
- На следующий день выберите одну колонию из lin-53 или пустых векторных планшетов LB-агара с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл и инокулируйте каждую из них в отдельную культуральную пробирку, содержащую 2 мл жидкой среды LB с добавлением 50 мкг/мл карбенициллина. Выращивайте культуры в течение ночи при 37 °C до тех пор, пока они не достигнут оптической плотности (OD) при 600 нм 0,6 – 0,8. Измерьте внешний диаметр с помощью спектрофотометра.
ВНИМАНИЕ: Жидкая среда LB не должна содержать тетрациклин, в отличие от пластины LB-агара, используемой для удаления бактерий из глицеринового запаса, поскольку включение тетрациклина во время кормления приводит к снижению эффективности РНК-интерференции.
- Добавьте по 500 мкл каждой бактериальной культуры (lin-53 или пустой вектор) в 6-сантиметровые РНК-интерференционные планшеты NGM-Agar с помощью мультипипетки. Инкубируйте тарелки с закрытой крышкой на ночь при комнатной температуре в темноте до просушки. В течение этого времени IPTG в планшетах NGM будет индуцировать выработку дцРНК в бактериях.
- Используйте не менее 3 планшетов на бактериальную культуру в одном эксперименте. Это обеспечит 3 технических повтора для каждого эксперимента.
- Высушенные РНК-интерференционные пластины NGM-агара с бактериями хранят при температуре 4 °C в темноте до двух недель.
3. Приготовление штамма C. elegans BAT28
- Поддерживайте штамм червей BAT288, содержащий трансгены otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] и ntIs1 [gcy-5prom::gfp] на бактериях OP50, используя стандартные планшеты NGM-Agar при 15 °C.
Примечание: Подробный протокол по культивированию нематод см. rol-6 (su1006) является доминирующим аллелем и широко используемым фенотипическим инъекционным маркером16, который вызывает типичное движение качения. Он используется в трансгене otIs305 для отслеживания hsp-16.2prom::che-1.
- Постоянно держите штамм BAT28 при температуре 15 °C, чтобы предотвратить предупредительную активацию трансгена hsp-16.2prom::che-1. Уменьшите воздействие температур выше 15 °C, максимально обрабатывая при этом нагрузку.
- Чтобы синхронизировать возраст червей, используйте технику отбеливания.
- Смыть 6 см пластины NGM-Agar, содержащие взрослых особей и яйца BAT28, используя буфер M9 объемом 900 мкл. Гранулированные черви центрифугированием при 900 x g в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 0,5 – 1 мл отбеливающего раствора и встряхивайте пробирку примерно 1 минуту, пока взрослые черви не начнут лопаться. Мониторинг осуществляется с помощью стандартного стереомикроскопа.
- Гранулируйте червей центрифугированием при 900 х г в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость.
- Промойте гранулу червяка 3 раза, добавив 800 μL буфера M9 и центрифугируя при 900 x g.
- Выложите очищенные яйца на свежие NGM-тарелки, засеянные бактериями OP50. Выращивайте обесцвеченную популяцию на бактериях OP50 при 15 °C до тех пор, пока они не достигнут стадии L4 (примерно 4 дня). Личинки L4 могут быть распознаны по белому пятну примерно на полпути вдоль вентральной стороны червя18 с помощью стандартного стереомикроскопа.
заметка: Чтобы достичь фенотипа превращения зародышевой клетки в нейрон при истощении lin-53, он должен быть истощен в родительском поколении (P0). Оценка конверсионного фенотипа проводится в следующем поколении (дочернее поколение F1). Для достижения истощения lin-53, уже находящегося в P0, животных L4 подвергают воздействию РНК-интерференции.
- Вручную перенесите 50 червей стадии L4 на репликацию с помощью платиновой проволоки на планшет NGM, который не содержит бактерий, и позвольте червям отойти от любых перенесенных бактерий OP50. Дайте червям пошевелиться по тарелке около 5 минут. Используйте бактерии из пластин NGM-Agar RNAi, ранее засеянных бактериями lin-53 RNAi (или пустой векторный контроль), для переноса на соответствующие пластины РНК-интерференции.
- Избегайте переноса бактерий OP50 на настоящие РНК-интерференционные планшеты. Работайте быстро, чтобы свести к минимуму время воздействия штамма на температуру выше 15 °C.
- Инкубируйте червей на пластинах NGM-Agar RNAi при 15 °C в течение примерно 7 дней, пока потомство F1 червей не достигнет стадии L3 – L4. Их можно четко отделить от животных P0, поскольку они крупнее и толще, чем потомство F1.
- Визуально проверьте под стандартным стереомикроскопом, демонстрирует ли потомство червей F1 фенотип выступающей вульвы (pvul), как показано на рисунке 1. РНК-интерференция против lin-53 обладает плейотропными эффектами и вызывает фенотип pvul, который может быть использован для оценки успешности РНК-интерференции против lin-53><.
заметка: РНК-интерференция против lin-53 также может вызывать летальность эмбрионов F1. Этот эффект усиливается, если планшеты подвергаются воздействию более высоких степеней, чем 15 °C, до того, как животные достигнут стадии L3 – L4. Мертвые эмбрионы можно распознать по задержке развития и отсутствию вылупления.
- Инкубируйте планшеты в темноте, так как IPTG чувствительна к свету.
4. Индукция перепрограммирования зародышевых клеток
- Инкубировали РНК-интерференционные планшеты, содержащие lin-53 и пустое потомство F1, обработанное векторной РНК-интерференцией, в течение 30 мин при 37 °C в темноте для активации CHE-1. Используйте вентилируемый инкубатор, так как он обеспечивает более эффективное воздействие теплового шока.
- Дайте животным, пострадавшим от теплового шока, восстановиться в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, а затем инкубируйте планшеты при температуре 25 °C в течение ночи в темноте.
- Используя стандартный стереомикроскоп, соединенный с источником флуоресцентного света, исследуйте животных под фильтром зеленого флуоресцентного белка (GFP) на наличие сигналов, полученных от gcy-5prom::gfp в средней части тела червей, как показано на рисунке 2. Установлен микроскоп для сигналов GFP: максимум возбуждения на 488 нм с максимум излучения на 509 нм.
- Оцените степень конверсии зародышевых клеток в нейроны путем установки животных с сигналами GFP в средней части тела на предметные стекла микроскопии, содержащие агаровые прокладки.
- Подсчитайте количество животных, у которых происходит преобразование зародышевых клеток в нейроны, по сравнению с темными животными, чтобы оценить пенетрантность фенотипа. Как правило, около 30% животных демонстрируют дискретные сигналы GFP в зародышевой линии при истощении lin-53, в то время как не более 5% животных демонстрируют диффузные сигналы GFP в зародышевой линии на пустой векторной РНК-интерференции.
