Дисклеймер: Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Механическая гомогенизация головного и спинного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, описанные в этом разделе, достаточны для гомогенизации половины головного или спинного мозга.
- Предварительно охладите стеклянный раствор тканевого измельчителя Dounce (Table of Materials) на льду.
- Добавьте в раствор 3 мл предварительно охлажденного 1x сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS).
- Перенесите ткань (головной или спинной мозг) из лунки 6-луночной пластины в стеклянную ступку, убедившись, что она погружена в 1x HBSS и находится на дне раствора.
- Аккуратно разбейте ткань 10 ударами пестика А, а затем 10 ударами пестика В. Переложите гомогенизированную смесь в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
- Наполните пробирку до конечного объема 10 мл с помощью предварительно охлажденного 1x HBSS и центрифугируйте в течение 10 минут при 320 x g при 4 °C.
- Отсадите надосадочную жидкость и добавьте ледяной 1x HBSS в каждую пробирку до конечного объема 7 мл и осторожно ресуспендируйте гранулу путем вортексирования.
2. Удаление мусора
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мусора, состоящего в основном из непереваренной ткани и миелиновых оболочек, является критически важным этапом для эффективного окрашивания гомогената ткани для последующих проточных цитометрических анализов.
- Отфильтруйте каждый образец через клеточное сетчатое фильтр размером 70 мкм, чтобы удалить любые непереваренные кусочки ткани. Этот этап особенно важен при работе с тканями спинного мозга, так как эти образцы с большей вероятностью содержат непереваренные фрагменты нервов или мозговые оболочки, которые могут повлиять на последующие этапы.
- Убедитесь, что конечный объем составляет 7 мл в каждой пробирке с образцом. Если нет, залейте ледяной 1x HBSS до 7 мл.
- Добавьте 3 мл предварительно охлажденного изотонического раствора Перколля (IPS) в каждый образец, чтобы получить окончательный объем 10 мл раствора, содержащего среду с градиентом плотности при конечной концентрации 30%. Аккуратно перемешайте образцы, чтобы убедиться, что они однородно перемешаны.
- Центрифугируйте образцы в течение 15 мин при 700 x g при 18 °C, установив ускорение центрифуги на 7 и тормоз на 0,
заметка: Центрифугирование должно занять примерно 30 минут.
- Аккуратно извлеките образцы из центрифуги.
заметка: На поверхности раствора должен быть виден белесый диск, состоящий из мусора и миелина. На дне пробирки должна быть видна гранула (содержащая интересующие клетки).
- Тщательно отсасывайте весь белесый диск мусора, а затем остальную надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не выбить гранулу. Оставьте около 100 μл раствора поверх гранулы ячейки, чтобы избежать риска ее случайного смещения.
- Добавьте 1 мл раствора блокирующего раствора проточной цитометрии (FACS) (BL), повторно суспендируйте гранулу путем пипетирования вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1000 мкл и перенесите образцы в пробирки объемом 1,5 мл.
- Центрифуга в течение 5 мин при 450 x g при комнатной температуре (RT).
- Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в соответствующем буфере, совместимом с последующими анализами
