$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка материалов
- Буфер для сортировки магнитно-активированных клеток (MACS): Приготовьте 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Таблица материалов) в PBS-/-.
- Коллагеназа для внутривенного введения стокового раствора (20 ЕД/мкл): Суспендировать порошок в PBS+/+ (Таблица материалов), аликвоте, и хранить при -20 °C.<бр/>
заметка: Коллагеназа IV требует, чтобы MgCl2 был полностью активен; не замораживайте-размораживайте раствор Коллагеназы в/в.
- Обезболивающий раствор: Смешайте 150 мкл кетамина (150 мг/кг), 25 мкл ксилазина (5 мг/кг) и 330 мкл бупрехеда (0,1 мг/кг) в 1 мл PBS-/-.
заметка: Готовьте обезболивающе-обезболивающий раствор импровизированно и не держите его дольше суток.
- Раствор гепарина (100 Ед/мл): Ресуспендируйте порошок в PBS-/-.
- Подготовьте инфузионную врезную систему, подключив трубку к графину Эрленмейера, заполненному PBS-/-. Подсоедините иглу 23 G к концу инфузионной трубки. Откройте вставку для инфузии и дайте PBS работать, пока в пробирке не исчезнут пузырьки.
- Подготовьте бинокулярную лупу, оснащенную фонарем.
2. Содержание мышей C57BL/6
- Для анализа миелоидных или Т-клеток ЦП (сосудистых сплетений) используйте по четыре мыши для каждой и объедините четыре ЦП (по две от каждого бокового желудочка, третьего желудочка и четвертого желудочка ЦП; всего для восьми мышей). Отказ от объединения ЦП сопряжен с риском невозможности обнаружить редкие иммунные популяции при ЦП из-за их низкой численности.
- Дайте мышам акклиматизироваться в течение как минимум 7 дней перед любым экспериментом. Держите мышей в условиях, свободных от патогенов, при постоянной температуре и влажности, в цикле свет/темнота 12/12 или 14/10 часов, с водой и стандартным гранулированным кормом в неограниченном количестве.
3. PBS перфузия и рассечение мозга
- Взвесьте каждую мышь и введите 10 мкл/г раствора смеси анестетиков и анальгетиков (шаг 1.3) внутрибрюшинно.
- Подождите около 30 минут для эффективной анальгезии (проверьте глубину анестезии, ущипнув пальцы мыши).
- Положите мышь под наркозом на спину на подставку для рассечения и прикрепите ее ладони к подставке для рассечения.
- Щипнув кожу животного щипцами и с помощью ножниц, вскройте живот, диафрагму и грудную клетку, чтобы обнажить сердце><.
заметка: Когда грудная клетка вскрывается, мозг становится бескислородным. Необходимо точно и быстро пройти через следующие этапы перфузии.
- Введите 20 мкл 100 ЕД/мл раствора гепарина непосредственно в левый желудочек.
- Тонкими ножницами сделайте надрез не менее 3 мм в правом предсердии, чтобы кровь могла оттекать из организма.
- Сразу после этого введите иглу 23 G, размещенную на конце инфузионной трубки, через кончик левого желудочка.
- Откройте инфузионную систему на максимуме и дождитесь полной перфузии: с помощью иглы 23 G со скоростью потока около 6 мл/мин перфузия будет завершена за 3 мин.<бр/>
заметка: Равномерное изменение цвета органов, таких как печень, свидетельствует об эффективности перфузии.
- Закройте инфузионную систему и извлеките иглу из желудочка сердца.
- Снимите скотч с ладоней мыши. Поместите мышь в брюшное положение.
- Щипая кожу животного щипцами и с помощью ножниц, снимают кожу с макушки, от глаз до ушей.
- С помощью ножниц разрежьте череп сначала между глазами, а затем латерально от каждого глаза до спинного мозга чуть выше жевательных мышц. Для этого используйте оконечность ножниц и действуйте осторожно, чтобы не повредить мозг ножницами.
- Вскройте череп щипцами, зажав его от конечности между глазами.
- С помощью ножниц перережьте спинной мозг и извлеките мозг с помощью щипцов, расположив их две точки на боковой стороне мозга, чтобы наклонить его и поместить в чашку Петри, наполненную ледяным PBS+/+. Затем CP немедленно собираются.
заметка: Проверьте наличие обесцвечивания мозга для проверки эффективности перфузии.
4. Рассечение сосудистого сплетения из головного мозга
- Расположите мозг тыльной стороной вверх в чашке Петри и ниже целей бинокулярных луп.
- С помощью щипцов для удержания мозга на месте вставьте два конца другого щипца вниз через срединную линию между полушариями.
- С помощью щипцов оттяните кору головного мозга с мозолью и гиппокампом от перегородки, обнажая боковой желудочек и часть третьего желудочка.
- Определите латеральный ЦП как длинную вуаль, выстилающую боковой желудочек, который раздувается с обоих концов. Используйте два конца тонких щипцов, чтобы захватить латеральный КП. Будьте осторожны, чтобы собрать треугольную заднюю часть, которая может быть скрыта задней складкой гиппокампа.
- Оттяните кору, мозолистое тело и гиппокамп контралатерального полушария от перегородки, чтобы обнажить весь третий желудочек и противоположный боковой желудочек.
- Соберите третью КП с помощью тонких щипцов, которые можно идентифицировать как короткую структуру с зернистой поверхностью.
- Соберите другую боковую КП.
- Вставьте два конца щипцов между мозжечком и средним мозгом. Отделите мозжечок от моста и мозгового вещества, чтобы обнажить четвертый желудочек.
- Определите четвертую ЦП как длинную шаровидную структуру с зернистой поверхностью, которая выровняет четвертый желудочек от латерального правого конца до левого конца между мозжечком и мозговым веществом. Соберите четвертый КП тонкими щипцами.<бр/>
заметка: Покрытие щипцов на силановой основе может предотвратить липкость ЦП на щипцах.
- Повторите шаги 3.1-4.9 для каждой из остальных семи мышей. Тем временем собранный ЦП можно временно хранить в пробирке, помещенной на лед.
5. Подготовка образцов для анализа проточной цитометрии
- Наполните пробирку, содержащую все расчлененные CP, до 750 мкл PBS+/+.
заметка: При осаждении рассеченного ЦП тонкими щипцами в трубку образуется небольшой объем PBS+/+. Чтобы избежать возможной потери ткани ЦП, лучше восполнить имеющийся объем до 750 мкл, чем удалять и заменять его свежими 750 мкл PBS+/+.
- Добавьте 15 мкл 20 Ед/мкл стокового раствора коллагеназы внутривенно (см. шаг 1.2) для получения конечной концентрации 400 Ед/мл.<бр/>
заметка: ДНКаза I (150 мкг/мл) может предотвратить чрезмерное слипание клеток.
- Инкубировать ЦП с коллагеназой в/в при 37 °C при слабом перемешивании (300 об/мин) в течение 45 мин.
Аккуратно проводите - пипеткой вверх и вниз около 10 раз, чтобы завершить диссоциацию ЦП.
- Заполните CP-пробирку на 1,5 мл буфером MACS (см. рецепт, шаг 1.1), чтобы остановить внутривенную активность коллагеназы.
заметка: Активность коллагеназы IV останавливается при низких температурах и ингибируется сывороточным альбумином.
- Центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 1,5 мл буфера MACS.
- Центрифугируйте клетки при 500 x g в течение 5 мин, при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 220 мкл буфера MACS.