Получение смешанной культуры глиальных клеток из мозга неонатальной мыши

Аннотация

Источник: Sarkar, S. et al., Быстрая и уточненная магнитная изоляция CD11b первичной микроглии с повышенной чистотой и универсальностью. J. Vis. Exp. (2017)

В видео продемонстрирован метод выделения и культивирования клеток из мозга неонатальной мыши. Он включал ферментативную и механическую диссоциацию мозга с последующим культивированием в питательных средах, лишенных фактора роста нейронов, для получения смешанной глиальной популяции.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Выращивание смешанных глиальных культур

1. Быстро обезглавьте 1-2-дневных щенков с помощью 5,5-дюймовых операционных ножниц и сразу же поместите головы в пробирку объемом 50 мл на лед. Обратите внимание, что это обезглавливание является разновидностью эвтаназии.
2. В ламинарном капюшоне сделайте небольшой разрез в черепе и мозговых оболочках с помощью 4,5-дюймовых прямых микрорассекающих ножниц. Начинайте резку от хвостового конца к ростральному концу (носу). Проникните под кожу, используя отверстие, образованное в результате обезглавливания.
   1. После разреза отклейте одно из полушарий в сторону. Затем используйте пару изогнутых или крючковатых пинцетов, чтобы удалить весь мозг.
3. Погрузите мозг (мозги) в новую пробирку объемом 50 мл, содержащую 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), на 15 минут на водяной бане при температуре 37 °C. Используйте 2 мл трипсина-ЭДТА на мозг.
4. Промойте мозг (мозги) свежей питательной средой (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), модифицированной орлиной средой Dulbecco's Modified Eagle Medium/питательной смесью F12 (DMEM/F12), 1% пенициллином/стрептомицином, 1% L-глутамином, 1% пируватом натрия и 1% заменимыми аминокислотами), добавив и удалив среду. Повторите это 4 раза.
5. Для каждого мозга накладывайте по две колбы Т-75 с питательной средой. Поэтому добавьте в пробирку по 2 мл питательной среды на мозг. Таким образом, это будет эквивалент 1 мл гомогенизированного мозга с 8-9 мл питательной среды на колбу Т-75.
6. Гомогенизируйте путем растирания мозга (головных мозга) с помощью пипеток с различными размерами апертур, в порядке от самой большой к самой маленькой. Когда станет заметно, что мозговая ткань не становится меньше, переходите к следующей пипетке. В конце растирания суспензия должна быть чистой, без видимых кусков.
   1. Последовательно используйте пипетку объемом 25 мл, дозатор объемом 5 мл, а затем дозатор объемом 10 мл.
7. Пропустите каждую однородную мозговую суспензию через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 70 мкм, чтобы превратить ее в одну клеточную культуру.
8. На каждый гомогенизированный мозг положите две колбы Т-75 с питательной средой, как описано в шаге 1.5 (1 мл гомогенизированного мозга с 8-9 мл питательной среды на колбу Т-75).
9. Смените питательную среду через 6 д и выращивайте до изоляции на^16-й день.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM/F12 (1:1) (1 шт.)	Технологии Life	11330057
Пируват натрия	Технологии Life	11360070
MEM Заменимые аминокислоты (100x)	Технологии Life	11140050
L-глютамин (100x)	Технологии Life	25030081
Эдта	Научный центр Фишера	AM9260G
Фетальная бычья сыворотка	сигма	13Н469
0,25% Трипсин-ЭДТА	Gibco от Life Technologies	No 25200