1. Дифференцировка микроглии
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола представлен на рисунке 1.
- Культура индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)
заметка: Более подробную информацию о методах культивирования ИПСК можно найти в другом месте.
- Размораживание и обслуживание
- Приготовьте среду iPSC, аликотируйте ее и храните при температуре -20 °C до 6 месяцев. Разморозьте аликвоты на ночь при температуре 4 °C и используйте их до 1 недели. Перед использованием оставьте носитель при температуре окружающей среды не менее чем на 1 час.
- Покройте лунки 6-луночного планшета, добавив 1 мл 10 мкг/мл ламинина 521, разведенного в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS), содержащем кальций и магний. Держите планшеты в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 не менее 2 часов, а лучше на ночь. После разбавления ламинин хранить при температуре 4 °C в течение 3 месяцев.
- Приготовьте 10 мМ стокового раствора ингибитора Rhoкиназы Y27632 (ROCK Inhibitor) путем разведения в стерильной воде. Изготовьте одноразовые аликвоты раствора ингибитора ROCK и храните их при температуре -20 °C до 1 года.
- Приготовьте 0,5 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) путем разведения исходного раствора 0,5 М ЭДТА в DPBS.
- Чтобы разморозить флакон с замороженными ИПСК поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C до тех пор, пока он в основном не оттает. Немедленно перенесите содержимое флакона в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл среды iPSC. Центрифугируйте при 500 × г в течение 1 мин.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки, медленно добавляя 1 мл iPSC-среды, содержащей 10 μM ингибитора ROCK, к стенке трубки, чтобы не нарушать колонии клеток.
- Добавьте 1,5 мл среды iPSC, содержащей 10 μМ ингибитора ROCK, в каждую из лунок с покрытием и переведите ресуспендированные колонии по каплям в лунки, содержащие среду.
заметка: Используйте 5-7 капель из шага 1.1.1.6 для ухода за культурой, но отрегулируйте оптимальную плотность посева для каждой линии iPSC.
- Равномерно распределите ячейки в лунках, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и задом наперед. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2. На следующий день полностью замените среду, добавив свежую среду iPSC без ингибитора ROCK.
- Для поддержания среды меняйте каждый день до тех пор, пока клетки не достигнут 80% конфлюенции.
заметка: Клетки можно поддерживать без смены среды в течение 2 дней, если используемая среда iPSC позволяет гибкий график кормления. Рекомендуется ограничить это время до одного раза за пассаж и только в том случае, если клетки сливаются менее чем на 50%.
- расщепление
- Отсадите среду и промойте клетки 1 мл DPBS (без кальция и магния).
- Чтобы выбить клетки, добавьте 1 мл 0,5 мМ ЭДТА и инкубируйте в течение 2-3 минут при комнатной температуре, пока края клеточных колоний не поднимутся с поверхности лунки. Еще раз промойте клетки DPBS и добавьте 1 мл среды iPSC.
- Диссоциируйте клеточные колонии, аккуратно соскоблив их с помощью клеточного подъемника. Соскребите каждую область колодца только один раз, чтобы не потревожить колонии.
заметка: Альтернативные методы вытеснения колоний из колодца можно найти и в других местах.
- С помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл соберите клетки и перенесите их по каплям в соотношении 1:6 (клетки к среде) в лунки с предварительно нанесенным покрытием (как указано в шаге 1.1.1.2), содержащие 1,5 мл среды iPSC.
2. Дифференцировка iPSC в микроглиеподобные клетки (iMGs)
ПРИМЕЧАНИЕ: Малые молекулы и факторы роста растворяются в стерильно отфильтрованном 0,1% бычьем сывороточном альбумине в DPBS до исходной концентрации в 1,000 раз выше конечной концентрации. Рекомендуется дифференцировать иПСК в иМГ во время ранних пассажей. Рекомендуется проводить рутинное кариотипирование линий iPSC.
- Приготовьте стандартный раствор для покрытия
- Стоковый раствор реагента для покрытия внеклеточного матрикса разморозить на льду при температуре 4 °С в течение ночи.
- Предварительно охладите микроцентрифужные пробирки и наконечники фильтрующих пипеток при температуре 4 °C.
- Аликвотировать 250 мкл концентрированного реагента для покрытия внеклеточного матрикса в каждую пробирку и сразу же поместить на лед. Хранить аликвоты при температуре -20 °C.
- Для приготовления раствора покрытия разморозьте одну из аликвот реагента для покрытия внеклеточного матрикса на льду при температуре 4 °C в течение ночи.
- Добавьте 50 мл ледяной модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F12 (DMEM-F12), оптимизированной для роста человеческих эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (называемых DMEM-F12), в предварительно охлажденную коническую пробирку и держите ее на льду.
- Охладите наконечник дозатора объемом 1 мл, многократно дозируя ледяной DMEM-F12 вверх и вниз, а затем немедленно с помощью наконечника пипетки переведите 250 мкл реагента для покрытия внеклеточного матрикса в коническую трубку, содержащую среду DMEM-F12.
заметка: Стандартный раствор покрытия можно хранить в течение 2 недель при температуре 4 °C.
- Образование эмбриоидных тел (БЭ)
- Приготовьте среду EB, которую можно поддерживать при температуре 4 °C до 4 дней.
- Как только iPSCs достигнут 80% конфлюенции, диссоциируйте колонии, промыв 1 мл DPBS и добавив 1 мл диссоциационного реагента в течение 2 мин при 37 °C. Вытесните колонии с помощью клеточного лифтера, соскабливая несколько раз, чтобы получить одноклеточную суспензию. Соберите клетки и перенесите все в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DPBS.
- Центрифугируйте клетки при 500 × г в течение 1 мин, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды EB. Возьмите 10 μл клеток и разбавьте 1:1 трипановым синим. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и на основе количества клеток разбавьте клеточный запас до окончательного разведения 10 000 клеток на 100 мкл. Для гальванических ячеек добавьте 100 мкл разбавленных ячеек на лунку в 96-луночный планшет с круглым дном с низким адгезионным дном.
заметка: Как правило, 48 лунок из 96-луночной пластины могут быть получены из каждой 80% сливаемой лунки ИПССК.
- Центрифугируйте планшет при 125 × г в течение 3 минут и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 4 дней. На 2-й день проведите полусреднюю замену с помощью многоканальной пипетки и осторожно соберите 50 мкл старой среды, а затем добавьте обратно 50 мкл свежей среды EB.
заметка: На 4-й день ИПСК образуют сферические клеточные структуры, называемые БЭ, как описано в разделе результатов. При необходимости процесс дифференцировки БЭ может быть продлен до 7 дней.
- Генерация примитивных предшественников макрофагов (PMP)
- Приготовьте базовую среду ПМП, стерильно отфильтруйте и храните при температуре 4 °С до 1 месяца.
- Покройте лунки 6-луночной пластины, добавив 1 мл ледяного раствора для покрытия Matrigel, и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение не менее 2 часов или предпочтительно в течение ночи.
- На 4-й день дифференцировки БЭ перенесите БЭ в лунки, покрытые покрытием Матригель, собрав БЭ наконечниками пипетки объемом 1 мл (с помощью пипетки). Проводите пипеткой вверх и вниз один или два раза, чтобы выбить ЭБ из лунки. Держите 6-луночный планшет под наклоном, чтобы позволить EB осесть на краю лунки.
заметка: На одну лунку с покрытием можно нанести девять или десять EB.
- После того, как все БЭ осядут, аккуратно проведите пипетку и удалите старую среду с помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл, держа БЭ на краю лунки. Добавьте 3 мл свежеприготовленной среды PMP в каждую лунку. Равномерно распределите ячейки в лунках, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и задом наперед. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Не тревожьте пластину в течение 7 дней, чтобы позволить EB прикрепиться к дну колодца. По истечении этого времени выполните изменение полу-среднего с помощью полной среды PMP.
заметка: На этом этапе большая часть EB должна быть прикреплена к пластине. Любые плавающие EB могут быть удалены.
- Через 5-7 дней осмотрите ЭБ под микроскопом светового поля при 4-кратном увеличении, чтобы убедиться, что они прикреплены к дну лунок. Замените носитель, как описано в пункте 1.2.3.5. На 21-й день проведите полную смену среды с помощью 3 мл полной среды PMP.
заметка: Миелоидные предшественники, плавающие в среде, могут быть очевидны на этом этапе. Эти элементы следует отбраковывать во время смены среды.
- На 28-й день найдите в надосадочной жидкости круглые клетки, называемые PMP, и соберите среду, содержащую PMP, с помощью пипетки объемом 10 мл и автоматической пипетки. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить EB. Перенесите PMP и среду в коническую пробирку объемом 15 мл и действуйте, как описано в шаге 1.2.4.
заметка: Обычно PMP из одной и той же линии iPSC могут быть собраны из пяти лунок 6-луночного планшета и объединены вместе в одну коническую пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте 3 мл свежей среды PMP в сборе для дальнейшего поддержания БЭ. Поскольку PMP непрерывно выходят из EB в течение более 3 месяцев, собирайте их каждые 4-7 дней (не допускайте изменения цвета среды на желтый тон), как описано в шагах 1.2.3.7 и 1.2.3.8.
заметка: Хотя PMP могут собираться в течение нескольких месяцев, со временем они могут менять свой фенотип.
- Дифференциация iMG
- Приготовьте базовую среду iMG (Таблица материалов), стерильно отфильтруйте и храните при температуре 4 °C до 3 недель.
- После того, как PMP были собраны в коническую пробирку объемом 15 мл, центрифугируйте их при 200 × g в течение 4 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте PMP, используя 1-2 мл базальной среды iMG. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра, взяв небольшую аликвоту и разбавив в соотношении 1:1 с Трипаном синим.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,5-1,5 × 106 PMP обычно получают каждую неделю в зависимости от линии iPSC и возраста культуры EB.
- Остальные клетки снова центрифугируют при 200 × г в течение 4 мин. Разбавляют PMP до желаемой концентрации таким образом, чтобы клетки покрывались с плотностью ~105/см2 на планшетах, обработанных клеточными культурами, используя свежеприготовленную среду iMG complete. Каждые 3-4 дня в течение 10-12 дней выполняйте подмену полусреды с использованием свежеприготовленной полной среды iMG, чтобы обеспечить терминальную дифференциацию.
заметка: К этому моменту клетки должны приобрести морфологию, подобную микроглии. Чтобы подтвердить причастность PMP к судьбе микроглии, проводят иммунофлуоресцентный анализ, чтобы подтвердить экспрессию маркеров, обогащенных микроглией, таких как пуринергический рецептор P2RY12 и трансмембранный белок 119 (TMEM119).
- Чтобы сохранить здоровье и жизнеспособность клеток, проводите все эксперименты между 10 и 12 днями дифференцировки iMG.
