Дисклеймер: Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Диссоциация сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги (до сбора клеток) должны выполняться в шкафу биобезопасности A2 или B2 (BSC).
- Приготовьте смесь для диссоциации папаина/ДНКазы I следующим образом.
- Для шести сетчаток добавьте 75 мкл ДНКазы I в пробирку, содержащую 750 мкл папаина, и тщательно перемешайте (смесь диссоциации).
- Для индивидуальной подготовки образца, необходимой для этого протокола, разделите общий объем 825 мкл на три аликвоты: 275 мкл смеси в одной пробирке объемом 1,5 мл на каждую мышь (две сетчатки). Рассчитайте необходимые количества ДНКазы I и папаина соответственно.
заметка: До шести сетчаток могут быть диссоциированы в одной пробирке из смеси папаина/ДНКазы I. Тем не менее, индивидуальная подготовка образцов приводит к меньшему количеству сгустков и лучшему росту клеток по сравнению с комбинированными образцами.
- Перенесите две сетчатки в смесь диссоциации папаина/ДНКазы I. С помощью переводной пипетки с увеличенным диаметром наконечника соберите сетчатку, подождите, пока сетчатка остановится на дне наконечника, а затем выпустите сетчатку без чрезмерного количества сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) в пробирку, содержащую смесь папаина/ДНКазы I.
- Поместите на нутатор и инкубируйте его в течение 10 минут в инкубаторе для клеточных культур (37 °C, 5%CO2).
- Диссоциируйте клетки, тщательно пипетируя вверх и вниз (около 20-30 раз) пипеткой объемом 1 мл. После диссоциации клеток (т.е. получения однородного раствора без кусков) добавьте 275 мкл ингибитора овомукоидной протеазы из набора для диссоциации папаина, чтобы нейтрализовать папаин. Аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. ПРИМЕЧАНИЕ: Если шесть сетчаток были диссоциированы в 825 мкл смеси папаина/ДНКазы I, требуется 825 мкл овомукоида.
- Центрифугируйте смесь при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Добавить эпидермальный фактор роста (EGF, 1 мкл на 1 мл питательной среды, восстановленной при 200 мкг/мл в PBS) к расчетному объему питательной среды (1 мл на мышь), предварительно подогретой при 37 °С.
Примечание: В зависимости от плана эксперимента, маркер пролиферации 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), а также 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) или другие необходимые факторы могут быть добавлены в начале периода культивирования.
- Осторожно извлеките пробирки из центрифуги. Не прикасайтесь к грануле на дне трубки.
- Удалите надосадочную жидкость осторожно и полностью. Ресуспендируйте клеточную гранулу 500 мкл питательной среды с добавлением EGF.
- Перенесите клеточную суспензию в одну лунку маркированного 12-луночного планшета (рисунок 1C). Промойте пробирку еще 500 мкл питательной среды, обогащенной ЭФР, и добавьте ее в лунку (общий объем 1 мл на лунку).
- Повторите шаги 1.8 и 1.9 со всеми остальными образцами.
- Осторожно покачайте пластину лунки три раза (вперед и назад; влево и вправо). Поместите планшет в инкубатор (37 °C, CO2).
заметка: Если используются трансгенные мыши, проведите генотипирование для каждого животного (рис. 1D). Определите мышей с положительной и отрицательной рекомбиназой Cre и пометьте пластину соответствующим образом. Для этого протокола для следующих шагов использовались только клетки мышей с положительной рекомбиназой Cre. Клетки Cre-отрицательных образцов замораживаются и используются для других целей.
2. Фаза роста
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза роста длится около 4-5 дней (Рисунок 2B). Для добавления жидкости в лунки, содержащие клетки, пипетка должна быть направлена на стенку лунки, и жидкость должна высвобождаться медленно, чтобы избежать отслоения клеток. Не делайте пипетку непосредственно на верхней части клеток.
- Через сутки после диссоциации удалите среду и добавьте 1 мл свежей питательной среды, обогащенной EGF.
- На 3-й день удалите среду и добавьте 1 мл HBSS (комнатной температуры) для удаления клеточного мусора. Мягко покачивайте вперед и назад слева направо. Удалите HBSS, повторите этап промывки и добавьте 1 мл предварительно подогретой питательной среды с добавлением EGF.
- Наблюдайте за клетками каждый день и оценивайте состояние их роста до тех пор, пока клетки не достигнут 90%-100% слияния. На рисунке 3 показан пример хорошего роста МГ с течением времени. Проверьте на возможное загрязнение или гибель клеток. Выбросьте загрязненные культуры.
заметка: Чтобы контролировать и записывать состояние клеток, делайте снимки с различным увеличением с помощью светового микроскопа с подключенной камерой и объективами 4x, 10x или 20x. В данном исследовании используется флуоресцентный микроскоп.
3. Подготовка покровных покрытий с поли-L-орнитином (Poly-O) и ламининовым покрытием
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только в том случае, если выполняется иммунофлуоресцентное мечение и конфокальная лазерно-сканирующая микроскопия. Для правильной визуализации необходимы круглые стеклянные покровные стекла (диаметр 12 мм). Протокол нанесения покрытия также можно найти в техническом описании нейронной среды (см. Таблицу материалов).
- Осторожно поместите стерильные покровные стекла в центр каждой лунки 24-луночного планшета с помощью стерильных щипцов Dumont #2AP.
заметка: Поместите покровные стекла в центр колодца. Размещение покровных крышек близко к стенке скважины вызовет проблемы с поверхностным натяжением на следующих этапах.
- Разморозьте 2,5 мл Poly-O аликвоты при комнатной температуре и поместите 100 мл ее в центр каждого покровного стекла.
- Инкубируйте лунку в течение 30 минут в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Удалите Poly-O и трижды промойте колодец покровным стеклом ~1 мл стерильной воды.
- Дайте луночной пластине высохнуть в течение ночи в BSC. Разморозьте 2,5 мл ламинина при 4 °C на ночь.
- На следующее утро добавьте 100 μL Laminin в центр каждого покровного стекла и инкубируйте в течение 4 часов в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Удалите ламинин аккуратно и целиком.
- Держите пластину при температуре 4 °C, если пассирование не может быть выполнено немедленно.
заметка: Покровные стекла с покрытием в подготовленных пластинах могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 °C.
4. Клеточный пассаж для удаления выживших нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение клетки требуется для удаления нейрональных клеток, а не для увеличения популяции клеток. Глия делится всего несколько раз и дальше после пассажа расти не будет. Не стоит разбавлять клеточные суспензии. Ячейки одной сливающейся лунки 12-луночного планшета могут быть распределены на одну лунку 12-луночного планшета или две лунки 24-луночного планшета. При использовании покровных накладок с покрытием покрывается только около одной трети покровного стекла. Таким образом, из одной лунки конфлюентных ячеек 12-луночного планшета можно получить шесть покровных стекол, находящихся в 24-луночном планшете, с конфлюентными ячейками (~80%-90%). Другие соотношения также могут быть выбраны для увеличения или уменьшения плотности клеток. Для этого протокола используется одна мышь-репортер Cre+ [один эксперимент, две обработки: miR-25 или контроль-miR; технические реплики n = 3 (три покровных стекла за одну обработку), биологические реплики n = 1]. Количество технических и биологических репликатов может быть определено по-разному в зависимости от плана эксперимента.
- Проверьте, сливаются ли ячейки на 90%-100% (в том числе на краю лунки; Рисунок 3E, F).
- Удалите среду и добавьте 1 мл HBSS (комнатной температуры) для стирки. Аккуратно покачивайте тарелку (вперед и назад, влево и вправо). Полностью удалите HBSS.
- Добавьте 500 мкл предварительно подогретого раствора, содержащего трипсин (предварительно нагретого до 37 °C в металлической ванне с шариками), чтобы отделить клетки от лунки. Осторожно покачивайте (вперед и назад, слева направо) и инкубируйте в течение 2 минут в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Переместите пластину из инкубатора в БСК. Наклоняя, отсадите раствор, содержащий трипсин, и осторожно и медленно диспергируйте его по лунке несколько раз до полного отделения клеток. Держите тарелку против света и убедитесь, что на дне не осталось ячеек.
- Перенесите эту клеточную суспензию в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 8 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и осторожно восстановите клеточную гранулу, добавив 600 мкл (100 мкл на лунку для 6 лунок) предварительно подогретой питательной среды (с добавлением EGF; 1:1000) и пипетируя вверх и вниз ~30-40 раз><.
заметка: В это время клетки могут быть заморожены при температуре -80 °C или в жидком азоте и разморожены в соответствии со стандартными протоколами размораживания клеточных линий. Если клетки заморожены, они не будут ресуспендированы в среде с добавлением EGF (питательной среде). Они будут ресуспендированы в основной среде (без ЭФР) и замораживающем растворе (в соотношении 1/1).
- Затравочные клетки путем размещения 100 мкл суспензии ячейки/среды объемом 600 мкл в центре шести покрытых покровных стекол (см. шаг 5) 24-луночного планшета. Осторожно поместите тарелку в инкубатор и дайте ячейкам отстояться.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100 мкл суспензии клеток объемом 600 мкл (собранной из одной лунки 12-луночного планшета) приведет к 90%-100% слиянию клеток, что требуется для трансфекции.
- Проверьте ячейки через 3 часа, чтобы убедиться, что они осели на покровном листе. Добавьте 400 мкл питательной среды с добавлением EGF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки обычно готовы к трансфекции на следующий день (Рисунок 3G). Если они не сливаются (90%-100%), оставьте их на другой день. Если они все еще не сливаются, не используйте их для трансфекции. Если проводятся другие последующие приложения, такие как профилирование микроРНК, РНК-Seq, ОТ-кПЦР или вестерн-блоттинг, клетки необходимо пропустить в 12-луночные планшеты (соотношение 1:1; обработка планшетами не требуется) и собрать их для экстракции РНК/белка.
