Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание культуры глиальных клеток Мюллера, полученной из сетчатки мышей

1.2K просмотров

⸱

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

Источник: Kang, S., et al. Первичные клеточные культуры для изучения потенциала регенерации мышиной глии Müller после лечения микроРНК. J. Vis. Exp. (2022).

Это видео демонстрирует культивирование глиальных клеток Мюллера (MG), выделенных из сетчатки мышей. Сетчатка диссоциируется в одноклеточную суспензию с помощью пищеварительных ферментов. Затем клетки выращивают в среде с фактором роста, который способствует пролиферации MG-клеток и смертности нейрональных клеток. Мертвые нейрональные клетки удаляются во время пассирования, а клетки MG выращиваются для дальнейшего анализа.

Протокол

Дисклеймер: Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Диссоциация сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги (до сбора клеток) должны выполняться в шкафу биобезопасности A2 или B2 (BSC).

  1. Приготовьте смесь для диссоциации папаина/ДНКазы I следующим образом.
    1. Для шести сетчаток добавьте 75 мкл ДНКазы I в пробирку, содержащую 750 мкл папаина, и тщательно перемешайте (смесь диссоциации).
    2. Для индивидуальной подготовки образца, необходимой для этого протокола, разделите о....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 1: Диссоциация сетчатки и генотипирование. (A) Наглазник с удаленной роговицей, хрусталиком, радужной оболочкой и стекловидным телом. (B) Изолированные сетчатки; Клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) удаляются после тщательного промывания. (В) 12-луночная пластина с диссоциированной сетчаткой (по две сетчатки на лунку). (D) Вырезание примера изображения геля для генотипирования. Генот.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
животные
Мышь Ascl1-CreERT Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JЛаборатории Jax#012882Мышей Ascl1-CreERT скрещивали с мышами tdTomato
tdTomato-STOPfl/fl мышь B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JЛаборатории Jax#007914Генотипирование необходимо для идентификации Ascl1CreER положительных мышей
Реагентов
Поли-L-орнитина гидробромидСигма-ОлдричП4538-50МГвосстановлено в стерилизованной воде, замороженные аликвоты
Дополнение N-2Научный центр ФишераТел.: 17-502-048замороженные аликвоты
Нейробазальная средаНаучный центр ФишераТел.: 21-103-049используется в качестве питательной среды в разделе 1.1, хранить при температуре 4 °C
Система диссоциации папаинаУортингтон БиохимическийLK003153восстановлено в сбалансированном солевом растворе Earle's, замороженные аликвоты
Пенициллин стрептомицинНаучный центр ФишераТел.: 15-140-122замороженные аликвоты
L-глютаминНаучный центр Фишера25-030-081 (Английскийзамороженные аликвоты
HBSSНаучный центр ФишераТел.: 14-025-134хранить при температуре 4 °C
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Научный центр ФишераMT35010CVзамороженные аликвоты
Пластиковая посуда/расходные материалы
Микроцентрифужная пробирка 0,6 млНаучный центр ФишераТел.: 50-408-120
Микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 млНаучный центр ФишераТел.: 50-408-129
10 мкл стерильный фильтр TIP Наконечники для пипетокНаучный центр Фишера02-707-439 (Английский
100 мкл стерильный фильтр TIP TipsНаучный центр Фишера02-707-431 (Английский
1000 мкл стерильный фильтр TIP Наконечники для пипетокНаучный центр Фишера02-707-404 (Английский
Микроцентрифужная пробирка объемом 2,0 млНаучный центр ФишераТел.: 50-408-138
20 мкл стерильный фильтр TIP Tips для пипетокНаучный центр ФишераТел.: 02-707-432
Дозаторы с регулируемым объемом (2,5, 10, 20, 100, 200 и 1000 μл)Эппендорф2231300008
Одноразовые переводные пипеткиНаучный центр Фишера13-669-12
Плоскодонные пластины Multiwell с крышками, кол-во лунок=12Научный центр ФишераТел.: 08-772-29
Плоскодонные пластины Multiwell с крышками, кол-во лунок=24Научный центр ФишераТел.: 08-772-1
PIPET стерильный фильтр 10 мл одноразовые серологические пипеткиНаучный центр Фишера13-676-10Дж
PIPET стерильный фильтр 50 мл одноразовые серологические пипеткиНаучный центр Фишера13-676-10К
PIPET стерильный фильтр 5 мл одноразовые серологические пипеткиНаучный центр Фишера13-676-10Ч
Неопудренные нитриловые смотровые перчаткиНаучный центр Фишера19-130-1597Б
Круглые покровные стекла (диаметр 12 мм, толщина 0,17 - 0,25 мм)Научный центр Фишера22293232
Вакуумный фильтр, размер пор = 0,22 мкмНаучный центр ФишераТел.: 09-761-106
оборудование
1300 B2 Шкаф биобезопасностиТермо Сайентиал1310
Флуоресцентный микроскоп «все в одном» Keyence BZ-X 810Кейенс9011800000
Бинокулярный зум-стереомикроскопНаучное видениеВС-1ЭЗ-ИФР07
Одноразовые чашки Петри (диаметр 100 мм)ВВР25384-088 (Английский)
Щипцы Dumont #5 - Биология/ТитанИнструменты для точной науки11252-40
Щипцы Dumont #55 - Biologie/InoxИнструменты для точной науки11255-20
Изогнутые щипцы Dumont #7 - Биология/ТитанИнструменты для точной науки11272-40
Центрифуга Eppendorf 5430 RЭппендорф2231000508
CO2-инкубатор с водяной рубашкойВВР10810-744 (Английский)
) ) ) ) (английский) г.

Больше статей

Глиальные клетки Мюллеракультура сетчатки мышидиссоциация клеток сетчаткиобработка папаином и ДНКазой Iдобавка эпидермального фактора ростапротокол пассирования клетокудаление нейрональных клетокцентрифугирование при 300gотсоединение с использованием трипсинадобавка в ростовую среду