$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка буфера
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы выполняете нисходящее секвенирование РНК, тщательно обработайте все рабочие места и инструменты раствором для обеззараживания РНКазы, чтобы предотвратить деградацию мРНК.
- Приготовьте буфер для лизиса.
- Растворите в дистиллированной воде (H2O) до 50 мл: 5,47 г сахарозы (0,32 М конечная), 250 мкл 1 М хлорида кальция (CaCl2) (5 мМ конечная), 150 мкл 1 М ацетата магния (Mg(CH3COO)2) (3 мМ конечная), 10 мкл 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,1 мМ конечная), 500 μл 1 М Трис-соляной кислоты (Tris-HCl) (pH 8) (10 мМ final), 50 μL Triton X-100 (0,1% final) и 17 μL 3 M дитиотреитола (DTT, 1 mM final, добавить fresh) (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте буфер для сахарозы
- В дистиллированном H2O до 50 мл растворите: 30,78 г сахарозы (1,8 М конечный), 150 мкл 1 М Mg (CH3COO)2 (3 мМ конечный), 500 мкл 1 М Tris-HCl (pH 8) (10 мМ конечный), 17 мкл 3 М DTT (1 мМ конечный, добавить свежий).
2. Диссоциация замороженной ткани на одноядерную суспензию
- Добавьте 4 мл ледяного буфера для лизиса в стеклянную тканевую машину (кофемолку) объемом 7 мл и держите на льду. Рассеките примерно 200-400 мг свежезамороженной коры взрослого человека, опустите примерно в 50 раз и перенесите гомогенат ткани в ультрацентрифужную полипропиленовую пробирку объемом 12 мл.
- С помощью пипетки объемом 5 мл добавьте 6,5 мл ледяного буфера сахарозы на дно ультрацентрифужной пробирки, стараясь не нарушить слой между сахарозой и гомогенатом тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке дополнительных образцов тщательно сбалансируйте пробирки по весу, добавив дополнительный буфер для лизиса к более легкому образцу. Точная балансировка пробирок ультрацентрифуги имеет важное значение для предотвращения повреждения ротора и обеспечения вращения с нужной скоростью.
3. Ультрацентрифугирование
- Ультрацентрифугирование лизата при 24 400 об/мин (101 814 × г) в течение 1 ч при 4 °C. Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость и мусор, не повреждая гранул><ы.
заметка: Гранула может быть не видна, если начать с менее чем 200 мг ткани.
- Добавьте 600 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) (кальций (Ca2+), магний (Mg2+) free) в гранулы ядер и инкубируйте на льду в течение 10 минут перед повторным приемом.
- Проводите пипеткой вверх и вниз 50 раз, чтобы повторно суспендировать ядра на льду.
- Используйте гемоцитометр для визуализации интактных ядер под микроскопом и убедитесь, что концентрация ресуспензии выше10, 5 ядер/мл, прежде чем переходить к следующему этапу (соедините 10 мкл ресуспензирных ядер с 10 мкл трипанового синего).
4. Инкубация антител
- Для иммуномаркировки образца для сортировки ядра, активируемых флуоресценцией (FANS), добавьте 500 μL гранулы ресуспендированного образца, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ free), 10 μL 10% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (0,1% final), 1 μL мышиного антитела Anti-NeuN, конъюгированного с AF(Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, 1:1000 конечная концентрация), и 1 мкл мышиного антитела против PAX6, конъюгированного с аллофикоцианином (PAX6-APC, конечная концентрация 1:1000).
заметка: Могут быть добавлены альтернативные антитела, конъюгированные с другими флуорофорами. Здесь был использован мышиный анти-OLIG2, конъюгированный с AF488 (концентрация 1:1000), с благоприятными результатами.
- Выполняйте только 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и одноцветный контроль для настройки параметров стробирования, используя небольшое количество образца по мере необходимости.
- Для проведения одноцветного контроля AF555 добавьте 20 мкл ресуспендированной гранулы образца, 970 мкл 1x PBS (Ca2+, Mg2+ свободный), 10 мкл 10% BSA (0,1% в конечном итоге) и 1 мкл антитела NeuN-AF555 (концентрация 1:1000).
- Для проведения одноцветного контроля APC добавьте 20 μL ресуспендированной гранулы образца, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ свободный), 10 μL 10% BSA (0,1% final) и 1 μL антитела PAX6-APC (концентрация 1:1000).
- Чтобы выполнить контроль только DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол), добавьте 20 мкл ресуспендированной гранулы образца, 970 мкл 1X PBS (Ca2+, Mg2+ свободный) и 10 мкл 10% BSA (0,1% конечный) (DAPI будет добавлен позже, см. 4.4).
заметка: Если используется более двух антител, рекомендуется проводить контроль флуоресценции минус одного (FMO) в дополнение к одноцветному контролю.
- Инкубируйте образцы и контрольные элементы с вращением в темноте в течение 1 ч при температуре 4 °C.
- Добавьте DAPI в масштабе 1:1000 ко всем образцам и контрольным элементам и приступайте к сортировке.