Выделение клеточных популяций из ткани мозга с помощью сортировки ядер, активируемых флуоресценцией

Аннотация

Источник: Mussa, Z., et al. Выделение популяций астроцитов взрослого человека из свежезамороженной коры с использованием сортировки ядер, активируемых флуоресценцией. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует процедуру выделения и сортировки ядер из свежезамороженной ткани человеческого мозга с использованием флуоресцентно-активируемой сортировки ядер (FANS), которая позволяет изучать различные клеточные популяции для различных неврологических применений.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Подготовка буфера

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы выполняете нисходящее секвенирование РНК, тщательно обработайте все рабочие места и инструменты раствором для обеззараживания РНКазы, чтобы предотвратить деградацию мРНК.

1. Приготовьте буфер для лизиса.
   1. Растворите в дистиллированной воде (H₂O) до 50 мл: 5,47 г сахарозы (0,32 М конечная), 250 мкл 1 М хлорида кальция (CaCl₂) (5 мМ конечная), 150 мкл 1 М ацетата магния (Mg(CH₃COO)₂) (3 мМ конечная), 10 мкл 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,1 мМ конечная), 500 μл 1 М Трис-соляной кислоты (Tris-HCl) (pH 8) (10 мМ final), 50 μL Triton X-100 (0,1% final) и 17 μL 3 M дитиотреитола (DTT, 1 mM final, добавить fresh) (см. Таблицу материалов).
2. Приготовьте буфер для сахарозы
   1. В дистиллированном H₂O до 50 мл растворите: 30,78 г сахарозы (1,8 М конечный), 150 мкл 1 М Mg (CH₃COO)₂ (3 мМ конечный), 500 мкл 1 М Tris-HCl (pH 8) (10 мМ конечный), 17 мкл 3 М DTT (1 мМ конечный, добавить свежий).

2. Диссоциация замороженной ткани на одноядерную суспензию

1. Добавьте 4 мл ледяного буфера для лизиса в стеклянную тканевую машину (кофемолку) объемом 7 мл и держите на льду. Рассеките примерно 200-400 мг свежезамороженной коры взрослого человека, опустите примерно в 50 раз и перенесите гомогенат ткани в ультрацентрифужную полипропиленовую пробирку объемом 12 мл.
2. С помощью пипетки объемом 5 мл добавьте 6,5 мл ледяного буфера сахарозы на дно ультрацентрифужной пробирки, стараясь не нарушить слой между сахарозой и гомогенатом тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При обработке дополнительных образцов тщательно сбалансируйте пробирки по весу, добавив дополнительный буфер для лизиса к более легкому образцу. Точная балансировка пробирок ультрацентрифуги имеет важное значение для предотвращения повреждения ротора и обеспечения вращения с нужной скоростью.

3. Ультрацентрифугирование

1. Ультрацентрифугирование лизата при 24 400 об/мин (101 814 × г) в течение 1 ч при 4 °C. Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость и мусор, не повреждая гранул><ы. заметка: Гранула может быть не видна, если начать с менее чем 200 мг ткани.
2. Добавьте 600 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) (кальций (Ca²⁺), магний (Mg²⁺) free) в гранулы ядер и инкубируйте на льду в течение 10 минут перед повторным приемом.
3. Проводите пипеткой вверх и вниз 50 раз, чтобы повторно суспендировать ядра на льду.
4. Используйте гемоцитометр для визуализации интактных ядер под микроскопом и убедитесь, что концентрация ресуспензии выше^{10, 5} ядер/мл, прежде чем переходить к следующему этапу (соедините 10 мкл ресуспензирных ядер с 10 мкл трипанового синего).

4. Инкубация антител

1. Для иммуномаркировки образца для сортировки ядра, активируемых флуоресценцией (FANS), добавьте 500 μL гранулы ресуспендированного образца, 490 μL 1x PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ free), 10 μL 10% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (0,1% final), 1 μL мышиного антитела Anti-NeuN, конъюгированного с AF(Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, 1:1000 конечная концентрация), и 1 мкл мышиного антитела против PAX6, конъюгированного с аллофикоцианином (PAX6-APC, конечная концентрация 1:1000).
   заметка: Могут быть добавлены альтернативные антитела, конъюгированные с другими флуорофорами. Здесь был использован мышиный анти-OLIG2, конъюгированный с AF488 (концентрация 1:1000), с благоприятными результатами.
2. Выполняйте только 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и одноцветный контроль для настройки параметров стробирования, используя небольшое количество образца по мере необходимости.
   1. Для проведения одноцветного контроля AF555 добавьте 20 мкл ресуспендированной гранулы образца, 970 мкл 1x PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ свободный), 10 мкл 10% BSA (0,1% в конечном итоге) и 1 мкл антитела NeuN-AF555 (концентрация 1:1000).
   2. Для проведения одноцветного контроля APC добавьте 20 μL ресуспендированной гранулы образца, 970 μL 1X PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ свободный), 10 μL 10% BSA (0,1% final) и 1 μL антитела PAX6-APC (концентрация 1:1000).
   3. Чтобы выполнить контроль только DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол), добавьте 20 мкл ресуспендированной гранулы образца, 970 мкл 1X PBS (Ca²⁺, Mg²⁺ свободный) и 10 мкл 10% BSA (0,1% конечный) (DAPI будет добавлен позже, см. 4.4).
      заметка: Если используется более двух антител, рекомендуется проводить контроль флуоресценции минус одного (FMO) в дополнение к одноцветному контролю.
3. Инкубируйте образцы и контрольные элементы с вращением в темноте в течение 1 ч при температуре 4 °C.
4. Добавьте DAPI в масштабе 1:1000 ко всем образцам и контрольным элементам и приступайте к сортировке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x PBS pH 7,2	Инвитроген	70013073
КЛОН АНТИТЕЛ ПРОТИВ NEUN A60	Многородность	MAB377A5MI	мышиный анти-NeuN, конъюгированный с флуоресцентным соединением AF555 (возбуждение, 553 нм; излучение, 568 нм)
АНТИ-OLIG2 АНТИТЕЛО КЛОН 211	Многородность	MABN50A4MI	мышиный анти-OLIG2 конъюгирован с флуоресцентным соединением AF488 (возбуждение, 499 нм; излучение, 520 нм)
Бычий сывороточный альбумин	рыбак	БП9704-100
Счетная камера Bright-Line	Хауссер Сайентиал	3110В
Кальция хлорид безводный	рыбак	С614-3
Сетчатые фильтры, 40 μМ	SP Научное программное обеспечение	136800040
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)	Инвитроген	Д1306
Шлифовальный станок Dounce Tissue	Уитон	357542
Сортировщик FACS	BD Biosciences		BD FACSAria III
Тетрагидрат ацетата магния	рыбак	М13-500
PAX6 (PAX6/496) - 100 ТЕСТОВ	Новус	NBP234705J
Сахароза, сертифицированная кристаллами, ACS, 500 мг	рыбак	С5500
SW 41 Ti Ротор с качающимся ковшом	Бекман Коултер	331362
Tris-HCl, 1М раствор, pH 8,0, класс молекулярной биологии, сверхчистый	Термо Сайентиал	J22638AE
ТритонХ-100	рыбак	БП151-500	Неионогенное поверхностно-активное вещество в буфере для лизиса
Раствор трипана синего, 0,4%	Gibco	15250061
ультрацентрифуга	Beckman Coulter Optima XE-100	А94516
Ультрацентрифужные пробирки PP 9/16 X 3-1/2	Бекман Коултер	331372
Ультрачистая дистиллированная вода (без РНКазы, ДНКазы)	Инвитроген	10977023	обозначается как дистиллированная вода
Сверхчистый ЭДТА	Технологии Life	15576-028