Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Коллекция тканей
- Приготовьте буфер X из набора для нейронной диссоциации, добавив бета-меркаптоэтанол в буфер X до конечной концентрации 0,067 мМ (для 4 образцов добавьте 13,5 мкл 50 мМ бета-меркаптоэтанола в 10 мл буфера X).
- Приготовьте смесь ферментов 1, смешав 50 мкл фермента P с 1 900 мкл буфера X для каждого образца, как описано в протоколе набора для нейронной диссоциации Например, для 4 образцов смешайте 200 мкл фермента P с 7 600 мкл буфера X.
- Поместите Buffer X на водяную баню при температуре 37 ºC.
- Поместите 2 мл холодного буферизованного раствора соли Хэнка (HBSS) (без Ca++ и Mg++) в одну лунку стерильного 6-луночного планшета для культивирования каждого образца, который будет собран и храниться на льду для вскрытия тканей.
2. Нейронная диссоциация (1 час)
- Нарежьте каждый образец ткани на мелкие кусочки с помощью стерильных бритвенных лезвий на крышке 6-луночного планшета для культивирования. Этот протокол использовался для образцов тканей в дозе около 30 - 100 мг, но он одобрен для образцов тканей в дозе до 400 мг. Для образцов тканей с концентрацией более 400 мг объемы реагентов должны быть соответствующим образом увеличены.
- Используйте 1 мл свежего HBSS без Ca2+ и Mg2+ для переноса нарезанных кубиками кусочков ткани с помощью пипетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 2 мл. Повторяйте шаги 2.1 и 2.2 для всех образцов до тех пор, пока все образцы не будут перенесены в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
- Центрифугируйте образцы при давлении 300 x g в течение 2 мин в режиме ОТ и аспирируйте надосадочную жидкость.
- Добавьте 1 900 мкл теплой смеси ферментов 1, приготовленной на этапах 1.2 и 1.3, к каждому образцу и закройте пробирки.
- Инкубируйте образцы в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 ºC, переворачивая пробирки несколько раз каждые 5 минут, чтобы повторно суспендировать осевшие кусочки ткани.
- Тем временем приготовьте смесь ферментов 2, смешав 20 мкл буфера Y с 10 мкл размороженного фермента A (для 4 образцов смешайте 80 мкл буфера Y с 40 мкл размороженного фермента A).
- Добавьте 30 μл Enzyme Mix 2 в каждый образец и аккуратно переверните. Не делайте вихрей.
- Диссоциируйте каждый образец ткани с помощью пипетки Пастера «1», растирая вверх и вниз 30 раз.
- Инкубируйте образцы в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 ºC; переворачивайте пробирки несколько раз каждые 5 минут, чтобы снова суспендировать осевшие кусочки ткани.
- Диссоциируйте каждый образец ткани с помощью пипетки Пастера «2», растирая вверх и вниз 30 раз, избегая образования пузырьков.
- Диссоциируйте каждый образец ткани с помощью пипетки Пастера «3», растирая вверх и вниз 30 раз, избегая образования пузырьков.
- Инкубируйте образцы в течение 10 минут на водяной бане при температуре 37 ºC; переворачивайте пробирки несколько раз каждые 5 минут для повторного суспендирования осевших клеток.
- Нанесите суспензию одиночных клеток на штамм клеток размером 80 микрон, помещенный поверх пробирки сокола объемом 15 мл, чтобы удалить крупные частицы мусора, и промойте фильтр и клетки 10 мл HBSS (с Ca2+ и Mg2+), чтобы остановить ферментативные реакции. Повторяйте до тех пор, пока каждый образец не будет переложен в чистую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте образцы при 300 x g в течение 10 минут в режиме RT и отсасывайте из надосадочной жидкости.
3. Истощение миелина (45 мин)
- Тщательно повторно суспендируйте гранулы клеток с 400 μл буфера для удаления миелина.
- Добавьте указанное количество шариков для удаления миелина и пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать.
заметка: Объем используемых шариков для удаления миелина будет зависеть от размера ткани, возраста животного и количества миелина, ожидаемого в этой конкретной области мозга. Например, для образца гиппокампа взрослой крысы (примерно 300 мг) инкубируйте образец со 100 мкл гранул для удаления миелина.
- Выдерживать 15 минут в холодильнике при температуре 4 ºC.
- Промойте каждый образец 5 мл буфера для удаления миелина.
- Центрифугируйте образцы при давлении 300 x g в течение 10 мин при RT.
- Во время центрифугирования образцов поместите 1 колонку для каждого образца в магнитное поле магнитного сортировщика и поместите чистый фильтр 80 микрон поверх каждой колонки.
- Подготовьте колонки и профильтруйте, промыв каждую колонку 1 мл буфера для удаления миелина три раза (всего 3 мл). Соберите все проточные воды в контейнер для отходов, например на дно пустого ящика для чаевых.
- Поместите полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл непосредственно под каждую колонку при подготовке к сбору проб.
- Когда клетки закончат центрифугирование, аспирируйте надосадочную жидкость и тщательно повторно суспендируйте ее в 500 мкл буфера для удаления миелина. Немедленно нанесите клеточную суспензию на колонку и соберите клетки в пробирку ниже.
- Промойте фильтр и колонку буфером для удаления миелина 1 мл 4 раза (всего 4 мл).
- Центрифугируйте сбор клеток при 300 x g в течение 10 мин при RT.
- Аспирируйте надосадочную жидкость, и теперь клетки готовы к окрашиванию.
4. Окрашивание живых клеток для FACS (1 час для окрашивания)
- Кратковременно вихревыми (2 сек) клетки отделить гранулы и немедленно добавить 5 мкл Fc-блока (антикластеры дифференцировки 32, CD32), снова сделать вортекс и инкубировать в холодильнике при температуре 4 ºC в течение 5 мин.
- Между тем, приготовьте первичную смесь антител, добавив три первичных антитела в промывочный буфер следующим образом: 0,125 мкл аллофикикоцианина (APC) -конъюгированного антитела CD11b (1:800), 1 мкл анти-GLT1 антитела (1:100) и 0,4 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC) – конъюгированного антитела Thy1 (1:250) на каждые 100 мкл промывочного буфера. Каждый образец получит 100 μл первичной смеси антител для инкубации; Однако, если ваш образец намного больше 400 мг ткани, вы можете рассмотреть возможность соответствующего увеличения объема вашей первичной смеси антител
- Подготовьте пробирки для контроля одиночного окрашивания, удалив всего 2 мкл клеток из каждой пробирки с образцом и добавив их в каждую пробирку для контроля окрашивания. К контрольным группам «одинарного окрашивания» относятся: только APC-CD11b, только GLT1, только FITC-Thy1, только вторичные антитела ПЭ и «пустой» или неокрашенный контроль.
заметка: Все образцы должны быть представлены во всех контрольных значениях, таким образом, в каждую контрольную пробирку для окрашивания следует добавить 2 мкл клеток из каждого образца.
Кратковременно перебейте - пробирки (2 сек) и добавьте 100 мкл первичной смеси антител в каждую пробирку с образцом и 100 мкл соответствующего первичного антитела в каждую контрольную пробирку для окрашивания, снова закрутите пробирки, накройте пробирки алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентных антител от любого света и инкубируйте пробирки в холодильнике при температуре 4 ºC в течение 20 мин. Образцы следует хранить в прохладном месте (при температуре 4 ºC) в течение оставшейся части процедуры, чтобы сохранить целостность образцов и антител.
Кратковременно перебейте - пробирки и добавьте 2 мл промывочного буфера в каждую пробирку.
- Центрифужные пробирки при 350 x g в течение 5 минут при 4 ºC.
- Тем временем приготовьте смесь вторичных антител, добавив 0,2 мкл ПЭ-конъюгированного вторичного антитела против кролика на каждые 100 мкл промывочного буфера. Каждый образец получит 100 μл вторичной смеси антител; Однако, если ваш образец намного больше 400 мг ткани, вы можете рассмотреть возможность соответствующего увеличения объема вашей первичной смеси антител.
- Когда центрифугирование будет завершено, слейте надосадочную жидкость с каждого образца в раковину и промокните пробирки вверх дном на бумажном полотенце.
- Кратковременно сделайте пробирки вихревыми и добавьте 100 мкл смеси вторичных антител в каждую пробирку с образцом и соответствующее вторичное антитело в каждый контроль окрашивания. Затем снова закрутите трубки, накройте их алюминиевой фольгой и выдержите в холодильнике при температуре 4ºC в течение 15 мин.
заметка: Контрольная трубка для окрашивания, предназначенная только для GLT1, должна получить вторичную смесь антител.
- После инкубации кратковременно перебейте пробирки и добавьте в каждую пробирку по 2 мл промывочного буфера.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 350 x g в течение 5 минут при 4ºC.
- Когда центрифугирование будет завершено, слейте надосадочную жидкость с каждого образца в раковину и промокните пробирки вверх дном на бумажном полотенце.
- Сделайте пробирки вихревыми и добавьте в каждую пробирку 0,25 мл стерильного PBS. Образцы готовы к сортировке.
заметка: Для большего количества клеток может потребоваться 0,5 мл стерильного PBS; Тем не менее, лучше всего начать с меньшего объема, так как образец всегда может быть разбавлен, если он слишком концентрирован на клетках.
заметка: По желанию добавьте DNase в пробирку, чтобы предотвратить слипание клеток и, таким образом, засорение сортировщика. Образцы также могут быть отфильтрованы с помощью стерильного фильтра 80 микрон непосредственно перед сортировкой, чтобы избежать засорения сортировщика.
