1. Подготовка и сбор старых червей для выделения клеток
- Соберите червей и подготовьте буферы для изоляции клеток.
- Соберите червей в коническую пробирку объемом 15 мл. Промыть червей с планшета 1,5 мл буфера M9 (1 мМ MgSO4, 85 мМ NaCl, 42 мМ Na2HPO4·7H2O, 22 мМ KH2PO4, pH 7,0) и центрифугировать в течение 5 мин при 1 600 x g. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте червей 1 мл буфера M9. Повторите центрифугирование и промойте в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше загрязнения Escherichia coli.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков (50 мкг/мл), таких как ампициллин, на этом этапе может помочь уменьшить бактериальное загрязнение.
- Для двух образцов приготовьте 2 мл буфера для лизиса додецилсульфата-дитиотреитола натрия (SDS-DTT): 200 мМ DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота) (pH 8,0) и 3% (w/v) сахарозы.
- Приготовьте 15 мл изоляционного буфера (118 мМ NaCl, 48 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2, 25 мМ HEPES [pH 7,3]) и храните его на льду.
заметка: Как буфер для лизиса SDS-DTT, так и буфер для изоляции необходимо обновлять перед каждым экспериментом.
- Нарушение кутикулы и выделение одиночных клеток
- Центрифужные животные, собранные на этапе 1.1.1, в течение 5 мин при плотности 1 600 x g. Удалите все надосадочные и суспензионные черви в 1 мл среды M9 и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Гранулированные червячки с центрифугированием при 1 600 x g в течение 5 мин.
- Добавьте 200 мкл буфера для лизиса SDS-DTT к червям и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Черви должны казаться «подмигивающими» вдоль тела, если смотреть под световым микроскопом.
заметка: Длительное воздействие лизисного буфера SDS-DTT может привести к гибели червей, которую можно контролировать, наблюдая за червями. Мертвые черви удлинятся и не будут скручиваться.
- Добавьте 800 μL ледяного изоляционного буфера и перемешайте, осторожно переворачивая трубку.
- Гранулировать червей в течение 1 минуты при 13 000 х г при 4 °C, удалить надосадочную жидкость и промыть 1 мл изоляционного буфера.
- Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности пять раз, каждый раз осторожно удаляя изоляционный буфер.
- Добавить в гранулу 100 мкл протеазной смеси из Streptomyces griseus (15 мг/мл) (Таблица материалов), растворенной в изоляционном буфере, и инкубировать в течение 10−15 мин при RT.
заметка: Как и в случае с буфером для лизиса SDS-DTT, расширенное расщепление протеазы может привести к чрезмерному расщеплению белков вдоль плазматической мембраны, препятствуя выделению зеленого флуоресцентного белка (GFP) с помощью магнитных шариков.
- Во время инкубации со смесью протеаз применяйте механическое разрушение, пипетируя образцы вверх и вниз по дну микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл с наконечником микропипетки объемом 200 мкл в течение ~60−70 раз. Держите наконечник пипетки у стенки микроцентрифужной пробирки с постоянным давлением, чтобы правильно диссоциировать клетки.
- Чтобы определить стадию пищеварения, извлеките небольшой объем (~1−5 мкл) смеси для пищеварения, опустите ее на предметное стекло и осмотрите с помощью микроскопа для тканевых культур. Через 5−7 минут инкубации фрагменты червя должны заметно уменьшить кутикулу, и будет хорошо видна суспензия клеток.
- Остановить реакцию с помощью 900 мкл коммерчески доступной холодной среды L-15 Лейбовица с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина).
- Гранулированные фрагменты и клетки изолированы центрифугированием в течение 5 мин при 10 000 x g при 4 °C. Гранулированные клетки еще дважды промыть гранулированными клетками 1 мл холодной среды, обогащенной L-15, чтобы убедиться в удалении излишков мусора и кутикулы.
- Суспензируйте гранулированные клетки в 1 мл среды, обогащенной L-15, и оставьте на льду на 30 минут. Возьмите верхний слой, примерно 700−800 μл, в микроцентрифужную пробирку. Этот слой содержит клетки без клеточного мусора и будет использоваться для последующей изоляции представляющих интерес клеток.
- Следуя инструкциям производителя, используйте автоматический клеточный счетчик или гемоцитометр для измерения клеточной плотности 10−25 мкл выделенных клеток.
2. Выделение GFP-положительных клеток с помощью проточной цитометрии
- Выделение GFP-положительных клеток методом проточной цитометрии
- Из суспензии выделенных клеток, собранной на стадии 1.2.12, центрифугировать клетки в течение 5 мин при 10 000 x g при 4 °C. Отбраковать надосадочную жидкость и суспензировать гранулированные клетки в среде, дополненной L-15, до плотности клеток не более 6 x 106 клеток/мл во избежание перегрузки проточного цитометра.
- Сортируйте клетки по GFP-положительной экспрессии с помощью проточного цитометра, способного сортировать образцы. GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве контроля для анализа, не связанного с клеточным типом.
- Культивирование выделенных клеток
- Планшет изолировал клетки в стерильный 6-луночный многолуночный планшет.
заметка: Эти пластины могут быть покрыты лектином арахиса для увеличения прикрепления клеток; Однако, если элементы должны быть использованы немедленно, этим шагом можно пренебречь.
- Поместите планшет в пластиковый контейнер и инкубируйте клетки при температуре 20 °C с помощью влажной салфетки или мягкой салфетки (добавьте 50 мкг/мл ампициллина в воду двойной дистилляции [ddH2O], чтобы предотвратить рост бактерий на салфетке), чтобы добавить влаги в клетки. Не инкубируйте в инкубаторе сCO2, так как повышенный уровеньCO2 может повредить клетки.
