Получение срезов мозжечка из эмбрионального мозга цыпленка

Аннотация

Источник: Hanzel, M., et al. Ex vivo Культура ломтиков мозжечка цыплят и пространственно направленная электропорация предшественников гранулярных клеток. J. Vis. Exp. (2015).

Видео демонстрирует приготовление ломтиков мозжечка. В нем подробно описана процедура выделения мозжечка из эмбриона цыпленка. Затем срезы получают из рассеченного мозжечка с помощью измельчителя тканей для дальнейшего экспериментального анализа.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Вскрытие куриного эмбриона День 14 (e14) Мозжечок

1. Инкубировать коричневые оплодотворенные куриные яйца при температуре 38 °C до эмбрионального дня 14.
2. С помощью ножниц для яиц обезглавьте эмбрион цыпленка в яйце и переместите голову в чашку Петри, содержащую ледяной фосфатный буферный раствор (PBS) (рисунок 1A).
3. С помощью стандартных щипцов сделайте разрезы за каждым глазом по всей ткани, удаляя глаза и верхнюю челюсть. Сделайте второй разрез по всей глотке, удалив нижнюю челюсть (рисунок 1B).
4. С помощью стандартных щипцов удалите всю кожу с поверхности черепа, сняв ее (рис. 1C), и удалите лобные и теменные кости, обнажив мозг.
5. С вентральной стороны удалите глоточный хрящ и вспомогательную мезенхиму.
6. В дорсальном аспекте осторожно удалите мезенхиму дорсально к заднему мозгу, стараясь не повредить пиа, и отделите весь мозг (Рисунок 1D).
7. Сделайте разрез по всей ткани между средним и задним мозгами мозга и отделите задний мозг, включая мозжечок (рисунок 1E).
8. Удалите весь мозжечок, сделав разрезы по всей ткани на обоих боковых соединениях мозжечка и крыльевой пластины заднего мозга, заботясь о сохранении целостности мозжечка на протяжении всего рассечения (Рисунок 1F). Также удаляют формирующееся сосудистое сплетение (рисунок 1G).
9. Переместите рассеченный мозжечок в ледяной сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS).

2. Культура среза мозжечка e14

1. Перенесите весь мозжечок на стерильную платформу измельчителя тканей с помощью шпателя или пипетки Пастера объемом 3 мл с отрезанным кончиком, чтобы расширить отверстие. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки.
2. Разрежьте весь мозжечок целиком в нужной ориентации при толщине 300 мкм с помощью комплекта измельчителя тканей со скоростью резки 50% от максимальной. Целостность тканей легче всего сохраняется в сагиттальном отделе; тем не менее, ориентация также является важным фактором для клеточного анализа (дендриты клеток Пуркинье сагиттально выровнены, в то время как аксоны гранулярных клеток идут поперечно, перпендикулярно плоскости дендритов клеток Пуркинье).
3. С помощью пипетки Пастера объемом 3 мл покройте нарезанный мозжечок ледяным HBSS.
4. Переложите ломтики HBSS в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую ледяной свежий HBSS, с помощью пастеровской пипетки объемом 3 мл с разрезанным кончиком.
5. Под препарирующим микроскопом, освещенным оптоволоконным источником света, обеспечить разделение отдельных срезов с помощью часовых щипцов.<бр/> заметка: Каждое вскрытие, от инкубации эмбриона до среза в питательной среде, занимает около 10-20 минут, в зависимости от опыта. Проводите вскрытие по одному, чтобы убедиться, что мозжечок проводит минимальное количество времени между обезглавливанием и культивированием ex vivo.

Результаты

Рисунок 1. Вскрытие мозжечка из эмбрионов цыплят Е14. (А) Обезглавьте цыпленка в яйце и переместите голову в чашку Петри с ледяным PBS. Удалите нижнюю челюсть и глаза, сделав разрез за глазами и глоткой (пунктирная линия). (В) Удалите кожу с поверхности черепа. (В) Удалите лобную и теменную кости, и (Г) удалите мозг из мезенхимы и хряща, окружающих его. (Д) Под рассекающим микроскопом определите р...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Измельчитель тканей Макилвейна	Микл Лаборатория Инжиниринг Лтд		Режьте на 300 мкм для достижения наилучших результатов.