Создание первичных смешанных культур глиальных клеток из спинного мозга мыши

Аннотация

Источник: Malon, J. T., et al. Получение первичных смешанных глиальных культур из ткани спинного мозга взрослой мыши. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует технику выделения и культивирования первичных смешанных глиальных клеток из ткани спинного мозга взрослой мыши. Протокол включает в себя ферментативное расщепление ткани с последующим удалением поврежденных клеточных мембран и миелиновых остатков для получения одноклеточной популяции. Затем клетки культивируют в средах, оптимизированных для роста смешанных глиальных клеток.

Протокол

1. Приготовление растворов в культуральной вытяжке в асептических условиях

1. Готовят питательные среды: полную модификацию Дульбекко среды Игла (cDMEM), содержащую DMEM (с 4,5 г/л глюкозы), 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 250 нг/мл амфотерицина B и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (2-ME; см. 1.1.1). Перемешайте и профильтруйте, простерилизуйте все остальные компоненты, а затем добавьте FBS. Храните питательную среду при температуре 4 ^°C.
   1. Приготовьте 50 мМ стокового раствора 2-ME/фосфатно-солевого буфера (PBS): добавьте 100 μл концентрированного 2-ME (14,3 M) в 28,6 мл 1x PBS и простерилизуйте фильтром (раствор можно хранить при 4 ^°C в течение нескольких месяцев). Используйте 1 мл стокового раствора 2-ME на каждые 1 000 мл питательных сред.
2. Приготовление градиентных сред плотности
   1. Приготовьте исходный раствор изотонической градиентной среды плотности (например, 100% Percoll) из 1 части 10x обычной стерильной PBS и 9 частей стерильной градиентной среды (например, Percoll).
   2. Разбавьте среду со 100% градиентом плотности (изготовленную в соответствии с 1.2.1) обычной стерильной средой 1x PBS для получения среды с градиентом плотности 20% (например, 10 мл среды со 100% градиентом плотности с 40 мл 1x PBS) и храните ее при температуре 4 ^°C. Доведите среду с градиентом плотности 20% до комнатной температуры (RT) перед приготовлением клеточной культуры.
3. Приготовление растворов из системы диссоциации папаина
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система диссоциации папаина может быть идентифицирована в таблице материалов. Также можно использовать другие подобные комплекты для диссоциации (в том числе собранные собственными силами). Все компоненты должны быть стерильными.
   1. Добавьте 32 мл сбалансированного солевого раствора Эрла (EBSS) в смесь (порошок) ингибитора овомукоидов.
   2. Добавьте 5 мл EBSS в один флакон (порошок) папаина. Поместите флакон с папаином на водяную баню при температуре 37 ^°C на 10 минут или до полного растворения папаина.
   3. Добавьте 500 μL EBSS в один флакон (порошок) DNase. Аккуратно перемешайте.
   4. Добавьте 250 мкл раствора ДНКазы (см. выше) во флакон с папаином.
   5. Рассчитайте общее необходимое количество вышеуказанной смеси папаина/ДНКазы (примерно 800 мкл смеси папаина/ДНКазы на спинной мозг мыши) и перенесите необходимую смесь в пробирку объемом 50 мл для переваривания тканей. Храните остатки в оригинальном флаконе при температуре 4 °C не менее двух недель.
   6. Храните все компоненты из наборов на льду до тех пор, пока они не понадобятся.
4. Подготовьте пробирки для сбора спинного мозга: одну стерильную трубку объемом 15 мл с 5 мл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS; из системы диссоциации папаина, для сбора спинного мозга) и одну стерильную трубку объемом 15 мл с 1x PBS (для наполнения шприца объемом 5 мл). Кроме того, приготовьте одну стерильную чашку Петри (35 мм или 60 мм) с 5 мл HBSS и храните ее в культуральном колпаке.

2. Приготовление одноклеточной суспензии

Примечание: Выполните шаги 3 и 4 в культурном шкафу, чтобы сохранить все стерильным.

1. Перенесите все спинные мозги в чашку Петри, содержащую HBSS. Разрежьте каждый из спинных мозгов на множество тонких мелких кусочков стерильными ножницами и щипцами. Перенесите ткань спинного мозга в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую приготовленную смесь ферментов папаина/ДНКазы (шаг 1.3.5), с помощью стерильных щипцов или пипетки объемом 10 мл (избегайте добавления HBSS в ферментную смесь, так как это еще больше разбавит приготовленный раствор фермента и может привести к снижению эффективности фермента).
2. Аккуратно перемешайте трубку вихрем. Инкубируйте пробирку при 37 ^°C в течение 1 ч в инкубаторе/шейкере с орбитальным встряхиванием при 150 об/мин.
Снова переведите
3. трубку в вихрь и энергично растирайте раствор фермента с тканью с помощью пипетки объемом 5 мл, чтобы способствовать дальнейшей диссоциации.
4. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
5. Во время центрифугирования смешать 2,7 мл EBSS с 300 мкл восстановленного раствора альбумин-овомукоидного ингибитора (1.3.1) в стерильной пробирке. Добавьте 150 мкл раствора ДНКазы (шаг 1.3.3).
6. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу приготовленным выше раствором (шаг 1.5). Вихревой колодец разбить ячейку с пеллетой.
7. Добавьте 3 мл восстановленного раствора альбумин-овомукоидного ингибитора (шаг 1.4.1) в клеточную суспензию. Центрифугируйте ячейки при 70 х г в течение 6 мин при РТ. Удалите надосадочную жидкость (которая содержит фрагменты мембраны).

3. Дальнейшее удаление миелина из суспензии одиночных клеток

1. Добавьте 8 мл градиентной среды 20% плотности (приготовленной на шаге 1.2.2) в пробирку, содержащую клеточную гранулу, осторожно перемешайте, чтобы разрушить гранулу, и центрифугируйте клетки при 800 x g в течение 30 минут при RT без торможения. Осторожно удалите верхний слой мусора (в основном миелин) и надосадочную жидкость, но сохраните гранулы.
2. Чтобы удалить остатки градиента плотности, промойте клетки, повторно суспензируя клеточную гранулу 8 мл разведенного cDMEM (1 часть cDMEM и 2 части HBSS). Центрифугируйте клетки при 400 x g в течение 10 мин при 4 ^°C. Удалите надосадочную жидкость и снова промойте клетки разбавленным cDMEM (см. выше) таким же образом. Держите клетки на льду до тех пор, пока они не засеют их.
3. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в питательных средах (cDMEM поставляется с 2-МЕ (приготовлено на шаге 1.1)). Для одного 12-луночного планшета используйте 3 мл x 4 (количество используемых мышей) + 2 мл = 14 мл среды. Это обеспечит достаточное количество клеточной суспензии для всего планшета (12 лунок) и обеспечит дополнительные лунки, которые можно использовать для определения среднего количества клеток на лунку и микроглиального содержания культуры. Если будут использоваться другие типы питательных емкостей, рассчитайте общий объем необходимых питательных сред пропорционально.
4. Добавьте по 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 12-луночного планшета.
5. Инкубируйте клетки при 35,9 ^°C с 5%_CO2.
6. Меняйте среду (удаляйте старую среду с помощью аспирации) на D 1, а затем каждые 3 - 4 дня после этого (обычно меняйте среду на D: 1, 4, 8 и 11, а затем используйте ячейки на 12 день).
   заметка: В 1-й день посев может содержать значительное количество мусора из-за остатка миелина из ткани спинного мозга; Таким образом, рекомендуется сменить носитель в 1-й день. Культуры готовы к обработке в период между D 12 - 14. Клетки обычно на 80% сливаются при D12 и могут быть почти на 100% сливаются к D14. Как правило, на D 12 имеется около 100 000 клеток на лунку в 12-луночном планшете.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модификация среды Орла (DMEM) Дульбекко с 4,5 г/л глюкозы	Лонза	12-709Ф	Среда cDMEM является стандартной, широко используемой средой для обработки культур. Каждый исследователь может решить, где приобрести DMEM и все другие компоненты, используемые для изготовления сред cDMEM.
L-глютамин (100x)	Лонза	17-605Э	L-глютамин является стандартным, широко используемым компонентом для различных питательных сред. Каждый исследователь может решить, где приобрести L-глютамин.
Антибиотик-антимикотический раствор (100x)	Корнинг-Медиатех	30-004-КИ	Это комбинация пенициллина, стрептомицина и амфотерицина, содержащая 10 000 единиц/мл пенициллина G, 10 мг/мл сульфата стрептомицина и 25 г/мл амфотерицина B. Отдельные исследователи могут решить, где приобрести отдельные компоненты.
2-меркаптоэтанол (2-ME)	Сигма-Олдрич	М3148	Биореагент, подходящий для клеточных культур, молекулярной биологии и электрофореза.
Система диссоциации папаина	Уортингтонская биохимическая корпорация	LK003150	Отдельные компоненты этого комплекта можно приобрести отдельно.
Перколл	GE Health Care	Тел.: 17-0891-01	Percoll продается в виде стерильного раствора. Неразбавленный Percoll при необходимости может быть повторно автоклавирован.
Инкубатор/шейкер Lab-line	Барстед/Лаб-лайн	МаксQ4000	Это инкубатор/шейкер, который у нас есть в настоящее время. Вместо этого можно использовать другие типы шейкеров.