Дифференцировка клеток-предшественников глазного отика в сенсорные эпителиальные клетки с последующим иммуноокрашиванием

Аннотация

Источник: Азаде, Д. и др., Инициирование дифференцировки в иммортализированных мультипотентных клетках-предшественниках Отика.J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует дифференцировку иммортализованных мультипотентных клеток отического предшественника (iMOP) в сенсорные эпителиальные клетки. В нем описаны этапы, связанные с культивированием клеток iMOP, формированием отосфер, индуцированием дифференцировки и визуализацией клеточных компонентов и маркеров дифференцировки с помощью флуоресцентной микроскопии для подтверждения успешной дифференцировки клеток.

Протокол

1. Поддержание самообновления в клетках IMOP

1. Готовят питательные среды iMOP: DMEM/F12, 1X добавку B27, 25 мкг/мл карбенициллина и 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Внесите 50 мл питательных сред iMOP с использованием стерильных реагентов. Разогрейте 49 мл DMEM/F12 в конической форме объемом 50 мл на водяной бане при температуре 37 °C.
   1. Разморозьте добавку 50X B27 и процедите стерилизованные 100 мг/мл аликвоты карбенициллина в течение 5 минут на водяной бане при температуре 37 °C. Разморозьте 100 мкг/мл аликвоты bFGF при RT. Добавьте 1 мл 50X B27, 10 мкл 100 мкг/мл bFGF и 12,5 мкл 100 мг/мл карбенициллина в DMEM/F12.
2. Используйте 3 мл среды в чашке для культуры тканей диаметром 60 мм для культивирования клеток iMOP. Добавляйте свежие носители в культуры через день, увеличив объем носителей в два раза. Следите за тем, чтобы концентрация bFGF не опускалась ниже 5 нг/мл.
   1. Культивируйте клетки iMOP при 37 °C с 5% CO_2. Пропустите клетки в культуру через 5 - 7 дней, как указано в следующих шагах. Перенесите культуру в коническую форму объемом 15 мл с помощью наконечника пипетки объемом 10 мл.
3. Сделайте 1 мМ ЭДТА в HBSS, разбавив 0,1 мл 0,5 М ЭДТА pH 8,0 в 50 мл HBSS. Предварительно разогрейте 1 мМ ЭДТА, изготовленную в HBSS, на водяной бане при температуре 37 °C.
4. Соберите камеры методом гравитационного осаждения или центрифугирования при давлении 200 x g в течение 5 мин при RT. Для гравитационного осаждения поместите коническую жидкость объемом 15 мл с культурами в инкубатор при температуре 37 °C на 5 - 10 минут. По истечении этого времени наблюдайте, как отосферы собираются на дне 15 мл конической.<бр /> заметка: Чрезмерная центробежная сила может привести к повреждению клеток.
5. Осторожно отсасывайте отработанную среду с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте в клеточную гранулу 0,5 мл предварительно подогретого 1 мМ раствора ЭДТА ГБСС. С помощью пипетки P1000 аккуратно пипетируйте вверх и вниз 2 - 3 раза. Поместите конус при температуре 37 °C и инкубируйте в течение <5 минут, чтобы облегчить диссоциацию на отдельные клетки.
6. Осторожно взбейте клеточный раствор, чтобы определить, диссоциированы ли отосферы. Если отосферы не оседают на дно конуса, клетки диссоциируют. Время инкубации может варьироваться.<бр/> заметка: Длительная инкубация с ЭДТА приведет к чрезмерной гибели клеток.
7. Удалите клетки при температуре 37 °C, добавьте 2 мл среды для нейтрализации и разбавления ЭДТА. Соберите клетки путем центрифугирования при 200 x g в течение 5 минут в RT. Отсадите разбавленный ЭДТА с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл и добавьте 5 мл 1X PBS для промывания клеток.
8. Вращайте клетки при 200 x g в течение 5 минут при RT и отсасывайте 1X PBS с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл. Ресуспендируйте клетки с помощью пипетки P1000 в 0,5 мл питательной среды iMOP путем осторожного пипетирования вверх и вниз 2-3 раза.
9. Подсчитайте клетки с помощью микрофлюидного счетчика частиц с соответствующими кассетами. Сливающаяся пластина ячеек iMOP будет содержать ~6 X10⁶ клеток. Развести клетки в соотношении 1:100 в среде и добавить 75 мкл раствора ячейки в кассету для подсчета. Планшет 1 x 10⁶ клеток в чашке 6 см в питательных средах iMOP (разведение ~1:10). Прохождение iMOPs каждые 5 - 7 дней.<чел/> заметка: Клетки, которые образуют большие отосферы или прикрепляются к дну чашки для культуры тканей, будут дифференцироваться. Клетки также погибнут, если культуры будут чрезмерно сливаться.

2. Дифференцировка клеток IMOP в сенсорный эпителий

1. Приготовьте 50 мл среды для дифференцировки сенсорного эпителия iMOP: DMEM/F12, 1X добавка B27, 25 мкг/мл карбенициллина. Сделайте 50 мл среды для дифференцировки сенсорного эпителия iMOP. Разогрейте 49 мл DMEM/F12 в конической форме объемом 50 мл на водяной бане при температуре 37 °C. Разморозьте 50X добавку B27 и 100 мг/мл аликвот карбенициллина в течение 5 мин. на водяной бане при температуре 37 °C. Добавьте 1 мл 50X B27 и 12,5 мкл 100 мг/мл карбенициллина в DMEM/F12.
2. Чтобы собрать, диссоциировать, восстановить и подсчитать клетки, повторите шаги 1.4-1.9
3. Планшет 1 x 10⁶ клеток в чашке 6 см в день -3 с использованием питательных сред iMOP. В день 0 перенесите культуры с помощью пипетки объемом 10 мл в коническую пипетку объемом 15 мл. Соберите отосферы путем гравитационного осаждения, как указано в шаге 1.6. Отсадите отработанную среду с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл и оставьте отосферы на дне конуса.
4. Аккуратно добавьте 2 мл среды для дифференцировки сенсорного эпителия. Переложите отосферы в чашку диаметром 6 см с помощью пипетки большого диаметра 10 мл.<бр/> заметка: Механический сдвиг от жесткого пипетирования может привести к диссоциации клеток от отосферы.
5. Добавляйте 2 мл свежей среды для дифференцировки сенсорного эпителия в культуры через день. При необходимости клетки могут быть собраны методом гравитационного осаждения и замененных сред.
6. Соберите отосферы на 10-й день, переложив ее в коническую форму объемом 15 мл и дав отосферам отложиться, как указано в шаге 1.6. Отсадите отработанную среду с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл и оставьте отосферы в покое.
7. Зафиксировать отосферы путем инкубации в 4% формальдегиде в 1X PBS в течение 15 мин при RT. Удалить раствор формальдегида и промыть отосферы промывочным буфером (1X PBS, содержащим 0,1% TritonX-100) перед инкубацией в блокирующем буфере (1X PBS, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100) в течение 1 часа.
   1. Замените буфер и инкубируйте образцы в блокирующем буфере с разведенным антителом. Инкубировать при 4 °C. Промыть образцы с помощью 1X PBS, содержащего 0,1% Triton X-100, и подвергнуть отосферу иммуноокрашиванию. Перенесите отосферы в 1X PBS и поместите отосферы в монтажные среды на предметном стекле с помощью пипетки P1000. Наденьте на образец покровное стекло и дайте монтажному материалу высохнуть при температуре 4 °C.
8. Получение эпифлуоресцентных изображений с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного 16-битной ПЗС-камерой и масляным иммерсионным объективом 20X 0,75 или 40X 1,3 NA. Собирайте флуоресценцию с разных цветовых каналов с помощью перечисленных (возбуждения и излучения) длин волн: синий (377 ± 25 нм/447 ± 30 нм), зеленый (475 ± 25 нм/540 ± 25 нм), красный (562 ± 20 нм/ и 625 ± 20 нм) и инфракрасный (628 ± 20 нм/ и 692 ± 20 нм).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 Толщина стеклянного покровного стекла (круглый 12 мм)	Науки электронной микроскопии	72230-01
DMEM/F12	Технологии Life	11320-082 (Английский)
Фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4	Технологии Life	10010-023
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Технологии Life	14025-092
Добавка B27 (50X) Без сыворотки	Технологии Life	17504-044	Хранится в виде аликвот по 1 мл
Крепление Prolong Gold Antifade Mountant	Технологии Life	47743-736	Хранится в виде 10 мг/мл 100 мкл аликвот
Автоматический счетчик ячеек Moxi Z Mini	Орфло	МХЗ001
Кассета Moxi Z Тип S	Орфло	МСК002
Рекомбинантный фактор роста мышиных фибробластов, основной (bFGF)	Пепротех	450-33	Ресуспендирован в 0,1% БСА в H20 и хранится в виде аликвот 20 мг/мл
Карбенициллин, динатриевая соль	Thermo Fisher Scientific	БП2648-1	Ресуспендирован в 10 мМ Hepes pH 7,4 и хранится в виде аликвот 100 мг/мл
Пипетка 5 мл в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200/футляр)	Thermo Fisher Scientific	1367811Д
Пипетка 10 мл в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200/футляр)	Thermo Fisher Scientific	1367811П
Обработанная культурой тканей чашка 6 см	Thermo Fisher Scientific	130181
Наконечник для фильтра TipOne 0,1-10 мкл удлиненный наконечник фильтра	США Сайентифик	1120-3810
Наконечник для фильтра TipOne 1-20 мкл	США Сайентифик	1120-1810
Наконечник для фильтра TipOne 1-200 мкл	США Сайентифик	1120-8810 (Английский)
Наконечник для фильтра TipOne 101-1000 мкл	США Сайентифик	1126-7810 (Английский
Конические тубы 15 мл стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб)	США Сайентифик	1475-0511
Конические тубы 50 мл стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб)	США Сайентифик	1500-1211

гг. гг. ) гг.