Методическая статья

Дифференцировка иммортализованных мультипотентных отических предшественников в спиральные ганглиозные нейроны и оценка дифференцировки

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Azadeh, J., et al. Инициируя дифференцировку в иммортализированных мультипотентных клетках-предшественниках ОТИКИ. J. Vis. Exp. (2016).

Видео демонстрирует дифференцировку иммортализированных мультипотентных отических предшественников (iMOPs) в спиральные ганглиозные нейроны (SGN) и подтверждение дифференцировки на основе иммунофлуоресценции. iMOP наносятся на покровные стекла, покрытые культуральным субстратом, в среду для дифференцировки нейронов для дифференцировки в SGN. Дифференцированные клетки помечаются антителами, специфичными к маркерам дифференцировки нейронов, и анализируются под микроскопом для подтверждения дифференцировки.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дифференцирование нейронов, производных от iMOP

  1. Приготовьте 50 мл среды для дифференцировки нейронов: нейробазальная среда, 1X добавка B27, 2 мМ L-глютамина. Разморозьте флакон 50X B27 и 200 мМ L-глютамина на водяной бане 37 °C в течение 5 минут. Добавьте 1 мл 50X B27 и 0,5 мл 200 мМ L-глютамина к 48,5 мл нейробазальной среды.
  2. Покройте покровное стекло, поместив 12 мм круглые 1,5 стеклянные покровные стекла в стерильную 10-сантиметровую пластину и добавьте 70% этанола (EtOH) в пластину для стерилизации и очистки покровных стекол.
  3. Осторожно взбалтывайте покровные стекла, чтобы убедиться, что они покрыты этанолом. Оставьте пластину на 10 минут на RT. Промойте покровные стекла 3 раза стерильным 1X-фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы смыть оставшийся этанол. Промойте покровное стекло один раз стерильным H2O, чтобы смыть оставшийся 1X PBS.
  4. Отсадите H2O с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл и дайте покровным стеклам высохнуть. Подвергните покровные стекла воздействию ультрафиолетового излучения в капюшоне для культуры тканей на 15 минут. Храните покровные листы в стерильном месте, если они не используются сразу.
  5. Поместите по одному круглому покровному стеколе 12 мм в каждую лунку посуды на 24 лунки. Осторожно встряхните пластину, чтобы покровные стекла лежали ровно на дне колодца.
  6. Разморозьте 2 мг/мл стокового раствора поли-D-лизина при комнатной температуре (RT) и разбавьте до концентрации поли-D-лизина до 10 мкг/мл в 1X PBS. Добавьте в лунки 0,25 мл 10 мкг/мл поли-D-лизина. Оставьте тарелку в инкубаторе при температуре 37 °C на 1 час.
  7. Промойте лунки 3 раза стерильным 1X PBS. Разморозьте 10 мг/мл стокового раствора ламинина в режиме ОТ и разведите до 10 мкг/мл в 1X PBS. Добавьте 0,25 мл рабочего раствора ламинина 10 мкг/мл в одну лунку многолуночной чашки на 24 лунки. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C инкубатора. Отсадите раствор ламинина с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл.
  8. Промойте покровное стекло 3 раза с помощью 1X PBS, добавив 1 мл 1X PBS с помощью пипетки P1000 и удалив 1X PBS путем аспирации с помощью аспирационной пипетки объемом 2 мл. Оставьте 1X PBS с момента последней промывки в лунке до тех пор, пока ячейки не будут готовы к нанесению на пластины. Инициирует дифференцировку нейронов путем сбора, диссоциации и подсчета клеток. Тарелка 1 х 106 клеток в посуде 6 см в День -3.
  9. В день 0 собирайте, диссоциируйте и подсчитывайте клетки. Засейте 1 x 105 - 1,5 x 105 iMOP клеток в 0,5 мл предварительно подогретых нейрональных дифференцировочных сред на лунку в 24-луночной чашке. Аспирируйте и добавляйте в культуры предварительно подогретые среды для дифференцировки нейронов через день.
  10. Фиксация нейронов, полученных из iMOP, в 4% формальдегиде в течение 15 мин. в режиме лучевой терапии на 7-й день. Удалить раствор формальдегида, промыть нейроны, полученные из iMOP, промыть промывочным буфером (1X PBS, содержащий 0,1% TritonX-100) перед инкубацией в блокирующем буфере (1X PBS, содержащий 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100) в течение 1 часа.
    1. Замените буфер и инкубируйте образцы в блокирующем буфере с разведенным антителом. Инкубировать при 4 °C. Промыть образцы с помощью 1X PBS, содержащего 0,1% Triton X-100, подвергая клетки иммуноокрашиванию. Промойте защитное стекло с помощью 1X PBS перед установкой на монтажный носитель. Дайте монтажному материалу высохнуть при температуре 4 °C перед получением эпифлуоресцентных изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 Толщина стеклянного покровного стекла (круглый 12 мм)Электронная микроскопия 772230-01
DMEM/F12Технологии Life11320-082 (Английский)
Нейробазальная средаТехнологии Life21103
Фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4Технологии Life10010-023
Добавка B27 (50X) Без сывороткиТехнологии Life17504-044Хранится в виде аликвот по 1 мл
L-глютамин (200 мМ)Технологии LifeNo 25030-081Хранится в виде аликвот по 5 мл
Натуральный мышиный ламининТехнологии LifeNo 23017-015Хранится в виде аликвот 1 мг/мл
Крепление Prolong Gold Antifade MountantТехнологии Life47743-736Хранится в виде 10 мг/мл 100 мкл аликвот
Автоматический счетчик ячеек Moxi Z MiniОрфлоМХЗ001
Кассета Moxi Z Тип SОрфлоМСК002
Поли-D-лизинсигмаП7886Ресуспендирован в 1X PBS и хранится в концентрации 10 мг/мл 100 мкл аликвот
Пипетка 5 мл в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200/футляр)Thermo Fisher Scientific1367811Д
Пипетка 10 мл в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200/футляр)Thermo Fisher Scientific1367811П
Обработанный тканевой культурой Biolite 24-луночный планшетThermo Fisher Scientific130188
Обработанный культурой тканей Biolite 6-луночный планшетThermo Fisher Scientific130184
Обработанная культурой тканей чашка 6 смThermo Fisher Scientific130181
Стерильный шприц EMD Millipore Millex PVDF Размер пор: 0,22 мкмThermo Fisher ScientificSLGV033RS
Наконечник для фильтра TipOne 0,1 - 10 мкл удлиненный наконечник для фильтраСША Сайентифик1120-3810
Наконечник для фильтра TipOne 1 - 20 мклСША Сайентифик1120-1810
Наконечник для фильтра TipOne 1 - 200 мклСША Сайентифик1120-8810 (Английский)
Наконечник для фильтра TipOne 101 - 1000 мклСША Сайентифик1126-7810 (Английский
Конические тубы 15 мл стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб)США Сайентифик1475-0511
Конические тубы 50 мл стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб)США Сайентифик1500-1211
г. гг. ) гг.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DCdkn1bTubb3

Похожие статьи