Все процедуры на животных моделях были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными, а ветеринарный наблюдательный совет JoVE рассмотрел все процедуры на животных моделях.
1. Спаривание по времени
- Место ISLMN:GFP (зеленый флуоресцентный белок островкового моторного нейрона; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock No: 017952) самец и самка мышей вместе на ночь. Взвесьте самок и запишите вес до начала спаривания.
Примечание: ISLMN:GFP специфически помечает моторные нейроны фарнезилированным GFP, который не является цитотоксичным, локализуется в клеточной мембране моторных нейронов и их аксонах и позволяет визуализировать нервы во время развития. Также можно использовать другие флуоресцентно помеченные линии.
- Проверьте наличие вагинальных пробок ранним утром. Дата идентификации вилки обозначается как E0.5.
- Подтвердите беременность с помощью набора веса и/или ультразвука на эмбриональный день 10,5 (E10,5). Беременные самки должны набрать не менее 1 г. Эмбрионы можно увидеть на УЗИ в точке Е10,5.
2. Приготовление реагентов и вибратома для культивирования срезов
- Приготовьте 500 мл буфера для нарезки: добавьте 5 мл HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновая кислота) и 5 мл пенициллина/стрептомицина к 500 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) без Ca2+ и Mg2+. Охладить до 4 °C.
заметка: Дополнительный буфер для нарезки должен храниться при температуре 4 °C и может быть использован для будущих экспериментов по культуре срезов.
- Приготовьте 50 мл питательных сред: В стерильный колпак добавьте 12,5 мл HBSS, 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 250 μл глюкозы, 250 μЛ L-глутамина, 125 μЛ HEPES к 24,4 мл Fluorobright DMEM (модифицированная среда Dulbecco Eagle). (Конечные концентрации: FlouroBright DMEM с 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% глюкозы, 1 мМ глутамина и 2,5 мМ HEPES). Нагрейте питательную среду до 37 °C на стерильной водяной бане.
заметка: Питательные среды могут храниться при температуре 4 °C до 3 недель.
- В стерильный колпак добавьте по 1,5 мл питательных сред в каждую лунку 6-луночного планшета. Добавьте в каждую лунку вкладыш для клеточных культур (Таблица материалов). Поместите в стерильный инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2.
- Приготовьте 4% низкоплавкую агарозу: растворите 2 г низкоплавкой агарозы в 50 мл стерильного PBS. Готовьте в микроволновой печи с интервалом 30-60 с до полного растворения. Поместите на водяную баню при температуре 40 °C для сохранения жидкости.
заметка: Излишки агарозы можно хранить при комнатной температуре (RT) и расплавлять для будущих экспериментов с культурами срезов.
- Настройка вибратома: Поместите новое лезвие на вибратом. Проверьте настройки: толщина 400-450 мкм. Предварительно охладите вибратомную стадию. Положите немного льда во внешнюю камеру. Используйте камеру и сцену, предназначенные для живых слайсов. Не используйте одну и ту же вибратомную камеру для неподвижных тканей, так как остаточный фиксатор может повредить срезы.
- Подготовьте микроскоп к верхней части инкубатора до 37 °C и 5%CO2.
- Подготовьтесь к вскрытию: очистите хирургические инструменты и распылите 70% этанола. Наполните две чашки Петри HBSS, положите на лед. Откройте 12-луночный планшет для культивирования тканей и положите крышку на лед нижней стороной вверх. Откройте 6-луночный планшет для культивирования тканей и поместите в каждую лунку вставки для мембран клеточных культур и 1,5 мл клеточных культуральных сред. Предварительно прогрейте тарелку в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2.
3. Сбор эмбрионов E10.5 и подготовка ломтиков
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги с этого момента должны быть выполнены как можно быстрее. Всегда держите эмбрионы на льду.
- Усыпить беременную самку (E10.5) в камере CO2. Выполнить вывих шейки матки.
- Опрыскайте брюшную полость 70% этанолом. Разрежьте живот ножницами, удалите матку и поместите ее в чашку Петри с ледяным HBSS, чтобы быстро смыть кровь. Переместите промытую матку во вторую Петри, наполненную блюдом с ледяным газом HBSS.
- Под рассекающим скопом извлекут эмбрионы из маточного рога и отдельных околоплодных мешочков. Поместите эмбрионы на нижнюю сторону крышки 12-луночной пластины. Держите на льду.
- Под зондоскопом для препарирования используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить любую жидкость, окружающую каждый эмбрион.
заметка: При прикосновении эмбрионы прилипнут к фильтровальной бумаге.
- Встраиваем эмбрионы в агарозу. Полейте растопленным агарозом каждый зародыш, чтобы покрыть его. Держите на льду. Как только агароза застынет, переверните каждый зародыш и засыпьте дополнительно агарозой с другой стороны. Держите на льду.
- С помощью флуоресцентного препарирующего эндоскопа обрежьте агарозу вокруг каждого эмбриона, чтобы она была правильно ориентирована при приклеивании к стадии вибратомии. Глазодвигательное ядро и раннее вырастание аксонов флуоресцентные. Выровняйте зародыш так, чтобы ядро, вырастающие аксоны и глаз образовали линию, и обрежьте агарозу бритвенным лезвием, разрезанным параллельно этой линии (дорсально по отношению к зародышу, см. рисунок 1А).
заметка: Это будет сторона, приклеенная к стадии вибратома (эмбрион будет расположен на спине, голова ближе всего к лезвию вибратома). Линия между глазодвигательным ядром и глазом должна быть параллельна лезвию вибратома.
- Заполните вибратомную камеру буфером для ледяных ломтиков. Приклейте эмбрион к стадии вибратома так, чтобы лезвие было параллельно глазодвигательному ядру и глазам. Как только суперклей высохнет, погрузите вибратомную стадию так, чтобы эмбрион был ориентирован лицом в сторону от лезвия.
- Нарежьте ломтиками 400-450 мкм. Соберите каждый ломтик стерильной переносной пипеткой. Поместите в холодный буфер для нарезки.
- В области препарирования выберите срез, содержащий глазодвигательные ядра и глаза. С помощью стерильной трансферной пипетки поместите ее на вставку для клеточной культуры в 6-луночный планшет. Верните планшет в инкубатор с температурой 37 °C. В качестве альтернативы пусть один человек нарезает ломтикой, а другой кладет ломтики. Минимизируйте время между нарезкой и помещением в инкубатор.
заметка: Срезы должны быть ориентированы таким образом, чтобы максимальная флуоресценция, излучаемая ядрами и аксонами, была ближе всего к объективу микроскопа. На инвертированном микроскопе срезы должны быть размещены на мембране с ядрами и аксонами, ближайшими к объективу под пластиной.
- Удалите остаточную агарозу со стадии вибратомии, приклейте следующий эмбрион к стадии и повторяйте шаги 3.7-3.9 до тех пор, пока все эмбрионы не будут нарезаны и покрыты.
- Добавьте ингибитор или рекомбинантную молекулу по выбору в среду в каждой лунке для создания кривой «доза-реакция». Разведите в соответствующем растворителе.<бр />
заметка: При использовании диметилсульфоксида (ДМСО) используйте только ДМСО. В качестве альтернативы, гранулы с белоковым покрытием могут быть размещены в определенных местах на ломтике.
- Поместите на микроскоп в камеру с температурой 37 °C и 5% CO2. Настройте микроскоп так, чтобы он делал фазово-контрастные и флуоресцентные фотографии каждого среза каждые 30 минут (или чаще, если хотите). Ломтики можно выдерживать в течение 48-72 часов.
