Выделение ганглиозных клеток сетчатки мыши с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией

Аннотация

Источник: Chintalapudi, S. R., et al. Выделение первичных ганглиозных клеток сетчатки мыши (РГК) с помощью проточной цитометрии. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует процедуру выделения первичных ганглиозных клеток сетчатки мыши (РГК) с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет в будущем изучать РГК с целью лучшего понимания значительного снижения остроты зрения, которое происходит в результате потери функциональных РГК при нейродегенеративных заболеваниях.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка инструментов, растворов и сред

Примечание: Вся информация о материалах, реагентах, инструментах и инструментах, указанная в протоколе, указана в Таблице материалов.

1. Автоклавируйте все инструменты для вскрытия и храните их в стерильном помещении. Используйте следующие инструменты: 4 стандартных щипца (2 длинных и 2 коротких) и 2 ножницы, а также 2 щипца (1 длинный и 1 короткий) и 1 ножницы для вскрытия; Держите дополнительный набор в качестве резервной копии.
2. Приготовьте 100 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS)/1% раствора фетальной бычьей сыворотки (FBS) для использования во время промываний, процедур иммуномаркировки и этапов сортировки клеток. Держите раствор охлажденным до 4 °C.
   заметка: Не добавляйте в раствор азид натрия (NaN₃), так как он может быть токсичен для живых клеток.
   1. Приготовьте 100 мл PBS/1% FBS с 99 мл PBS и 1 мл FBS.
3. Приготовьте 100 мл стерильной среды для нервных клеток с добавлением 3% FBS (см. Таблицу материалов) для использования в качестве среды для сбора и культивирования. Стерильную среду для клеточных культур хранить при температуре 4 °C. Перед использованием нагревайте его только до комнатной температуры (RT).
   1. Приготовьте 100 мл нейроклеточной среды с добавлением 3% FBS, используя 97 мл нейроклеточной среды и 3 мл FBS.
4. Предварительно охлаждаемые пробирки (пробирки объемом 15 мл) предварительно покрываются 5 мл собирательной среды, помещая их в ведро со льдом. Используйте только полипропиленовые трубки, чтобы предотвратить прилипание клеток к поверхности трубки.
5. Поместите в шкаф биобезопасности 40-миллиметровые тарелки, 70-метровые нейлоновые фильтры, шприцы, пестики для клеточного фильтра и стерильные полипропиленовые пробирки. Стерилизуйте все предметы перед процедурами и храните их в стерильном состоянии на протяжении всей процедуры><. заметка: Все действия после забора сетчатки будут выполняться в кабинете биобезопасности.

2. Приготовление суспензии клеток сетчатки

1. Поместите собранный глаз на опорную пластину диссекционного микроскопа, чтобы начать диссекцию роговицы. Рассекайте каждый глаз по отдельности.
2. Осторожно удерживайте глобус у основания зрительного нерва с помощью щипцов. Для этого шага используйте один длинный и один короткий стандартные щипцы.
3. Используйте острую иглу 30 калибра (30G) для прокола роговицы. Это позволит водянистой влаге выводиться из глаза, что облегчит удержание глаза щипцами.
4. Удерживайте роговицу щипцами и с помощью ножниц сделайте небольшой разрез в роговице. Аккуратно отшелушите роговицу и склеру с помощью щипцов. Когда глобус будет отклеен наполовину, сверните сетчатку и хрусталик с помощью щипцов. Выбросьте роговицу, склеру и хрусталик.
   заметка: Этот метод гарантирует, что сетчатка полностью отделяется от остальной части глаза.
5. Поместите сетчатку в маленькую 40-миллиметровую чашку Петри, содержащую PBS/1% FBS.
   заметка: В качестве альтернативы чашке Петри можно использовать чашку для клеточных культур. Следите за тем, чтобы сетчатка всегда оставалась влажной, как в физиологических условиях.
   1. Промойте каждую сетчатку три раза свежим стерильным PBS/1% FBS в боксе биобезопасности.
6. Поместите до 12 сетчатки на стерильное нейлоновое ситечко толщиной 70 мкм, смоченное PBS/1% FBS. Используя заднюю часть шприца объемом 10 мл, аккуратно мацерируйте сетчатку круговыми движениями, чтобы отделить клетки.
   1. В качестве альтернативы можно использовать пестик для мацерации клеточного фильтра или использовать ферментативное расщепление с комбинацией 15 МЕ/мл папаина, 5 мМ L-цистеина и 200 ЕД/мл ДНКазы I в течение 15 минут при 37 °C с последующей инактивацией PBS/10% FBS.
      заметка: Никаких изменений в проценте восстановленных клеток не наблюдалось при сравнении ферментативного расщепления с мацерацией с помощью тыльной стороны шприца или пестика.
7. Для переноса выделенных клеток поместите стерильный нейлоновый фильтр 70 мкм на полипропиленовую сборную трубку. Пропустите собранные клетки через сетчатое фильтр с помощью пипетки P1000. Промойте сетчатый фильтр (шаг 3.6) PBS/1% FBS, чтобы освободить оставшиеся клетки и перенести их в сборную пробирку.
8. Добавьте PBS/1% FBS для достижения конечного объема 1 мл на сетчатку. Центрифугировать клеточную суспензию в течение 7 мин при 200 x g и RT.
   Примечание: В зависимости от количества мацерированных сетчаток (< 6 сетчатки), клеточная гранула может быть слишком мала, чтобы быть видимой.
   1. Удалите надосадочную жидкость клетки и повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS/1% FBS в соотношении 1 мл на 5 сетчатки.
9. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
   1. Очистите стеклянным гемоцитометром и покровным стеклом 70% спиртом. Осторожно прокрутите трубку, содержащую клетки, чтобы убедиться, что суспензия клеток сетчатки равномерно распределена. Поместите 20 мкл 0,4% трипанового синего в микроцентрифужную пробирку и смешайте с 20 μл клеточной суспензии.
   2. Аккуратно перемешайте и нанесите 10 мкл 0,4% смеси трипановой синевой/клеточной суспензии на гемоцитометр, заполнив обе камеры; капиллярное действие втянет 0,4% трипановую суспензию сине-клеточной суспензии под покровное стекло. С помощью микроскопа подсчитать все трипановые синеотрицательные клетки; Это число представляет собой живые клетки.
   3. Определите жизнеспособность клеток по следующей формуле: количество живых клеток / общее количество клеток = % жизнеспособности.
      заметка: Если жизнеспособность клеток составляет менее 95%, требуется флуоресцентный краситель для определения жизнеспособности клеток во время флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS).
10. Используйте флуоресцентный краситель для повышения жизнеспособности, который не предназначен для живых клеток. Промойте клетки PBS, чтобы удалить любые следы сыворотки. Добавьте 1 мкл флуоресцентного красителя для определения жизнеспособности клеток на 5,0 x 106 клеток в конечном объеме 100 мкл. Инкубировать при RT в течение 15 мин в защищенном от света месте. Добавьте в 10 раз больше объема PBS/1% FBS. Центрифугируйте в течение 5 минут при 200 x g и RT.
11. При необходимости инкубировать клеточную суспензию в течение ночи при температуре 4 °С. Если это сделано, заполните трубку клеточной суспензии нейроклеточной средой, а не PBS/1% FBS. Поместите трубку горизонтально и поддерживайте ее при температуре 4 °C.

3. Иммуномаркировка клеток сетчатки

1. Используйте следующее преобразование для определения объема антител на номер клетки: 2 мкл антитела на 5,0 x 10⁶ клеток в объеме 100 мкл.
2. Вымойте клетки и поддерживайте их в PBS/1% FBS. Возьмите небольшую аликвоту ячеек (5,0 x 10⁶ ячеек) для использования в качестве отрицательного контроля (непомеченного) во время настройки сортировки.
   заметка: Этот отрицательный контроль имеет решающее значение для правильной калибровки сортировщика клеток.
3. Чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание антител с клетками, экспрессирующими рецепторы Fcγ II и III, добавьте 1 мкл антитела против мыши CD16/32 на 1,0 x 10⁶ клеток в конечном объеме 50 мкл с использованием PBS/1% FBS. Инкубировать в течение 10 минут при RT.
4. Добавьте коктейль антител к образцу и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Выдерживать 30 минут в ведре со льдом. Убедитесь, что ведро со льдом закрыто, так как свет может нарушить ход эксперимента из-за фотообесцвечивания помеченных флуорофоров.
   1. Приготовьте коктейль антител с использованием следующих флуоресцентно помеченных антител против мышей: CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (Phycoerythrin)-Cyanine7, CD15 PE и немеченый CD57.
      Примечание: Для каждого антитела используйте следующие концентрации на 5,0 x 10⁶ клеток: CD90,2 AF700, 1 мкг; CD48 PE-Cyanine7, 0,4 мкг; CD15 PE, 0,02 мкг; и немеченый CD57, 0,4 мкг.
      1. Используйте объемы в соответствии со следующими расчетами (на основе коммерчески доступных антител, перечисленных в Таблице материалов): всего 5,0 x 10⁷ клеток для мечения; 2 мкл на 5,0 x 10⁶ клеток = 20 мкл каждого антитела; 4 различных антитела = 80 мкл коктейля антител; конечный объем = [(5,0 x 10⁷ всего клеток)/5,0 x 10⁶ ячейки] x 100 = 1 000 μL; 80 μL Abs + 50 μL антимышиного CD16/32 + 870 μL PBS/1% FBS = 1 000 μL.
         заметка: Такая комбинация обеспечила оптимальную комбинацию флуорохромов для конфигурации прибора. Следующие параметры суммируют излучение и возбуждение: AF-700, излучение 719 нм при возбуждении красным диодным лазером с длиной волны 638 нм; PE-Cyanine7, излучение 767 нм при возбуждении лазером на синем диоде с длиной волны 488 нм; и ПЭ, излучение 575 нм при возбуждении с помощью лазера на синем диоде с длиной волны 488 нм.
5. После 30-минутной инкубации доведите объем до 5 мл с помощью PBS/1% FBS. Промойте образцы, центрифугируя их в течение 7 минут при 200 x g и RT. Повторите процедуру один раз, чтобы удалить все несвязанные антитела.
6. Добавьте 2 мкл вторичного антитела (0,1 мкг), которое свяжется с CD57 5,0 x 106 клеток. Инкубируйте в течение 30 минут в ведре со льдом, как в шаге 3.4. Промойте ячейки дважды, как в пункте 3.5.
   1. Пометьте клетки вторичным антителом, если на шаге 3.4.
      Примечание: Вторичное антитело выбора для этой конфигурации указано в Таблице материалов; Он имеет длину волны излучения 421 нм. Используйте его с полосовым фильтром 450/50 нм при возбуждении фиолетовым диодным лазером на длине волны 405 нм.
   2. Используйте объемы в соответствии со следующими расчетами (на основе коммерчески доступного антитела, перечисленного в Таблице материалов): 2 мкл на 5,0 x 10⁶ клеток = 20 мкл вторичного антитела; конечный объем = [(5,0 x 10 7 всего клеток)/5,0 x 10 ⁶ клеток] x 50 = 500 μл; 20 мкл Abs + 480 мкл PBS/1% FBS = 500 мкл.
7. Храните помеченные ячейки в PBS/1% FBS. Подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра; использовать концентрацию клеток сетчатки 3,0 - 4,0 x 10⁷ клеток/мл.
   заметка: Не используйте среду для клеточных культур для разбавления клеток, поскольку фенольный красный может увеличить автофлуоресценцию, тем самым снижая разрешение между отрицательными и положительными клетками. Конечная концентрация ячейки на объем в значительной степени зависит от объемного расхода конфигурации прибора.
8. Используйте одноцветные элементы управления во время настройки, чтобы свести к минимуму распространение флуоресценции.
   заметка: Этот шаг, также известный как компенсация, применяется для коррекции шума, создаваемого комбинацией флуорофоров. Микросферы полистирола в PBS/0,1% BSA/2 мМ NaN3, обладающие способностью связывать изотипы флуоресцентно меченых иммуноглобулинов (Ig) из нескольких видов, обеспечивают положительный контроль для установки компенсации.
   1. Поместите 3 капли полистирольных микросфер в стерильные пробирки FACS, выделив по одной на флуорофор. Добавьте 1 г соответствующего флуорофора в каждую пробирку. Инкубировать в течение 15 минут при RT в защищенном от света месте. Добавьте в пробирки с образцом 3 мл PBS/1% FBS. Центрифугируйте в течение 5 мин при 200 x g и RT. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 250 мкл PBS/1% FBS.
   2. Для настройки отрицательного контроля используйте микросферы из полистирола, которые не связываются с Ig. При необходимости проведите этот этап накануне.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антимышь CD15 PE	Биолегенда	125606	Клон МС-480
Антимышь CD48 PE-Cy7	Биолегенда	103424	Клон HM48-1
Антимышь CD57	Сигма Олдрич	К6680-100СТ	Клон VC1.1
Антимышь CD90.2 AF700	Биолегенда	105320 Телефонный номер 105320	Клон 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG	Биолегенда	405317	Клон Poly4053
Очищенный анти-мышь CD16/32	Биолегенда	101302	Блок FcgRII/III, клон 93
Фетальная бычья сыворотка	Гиклон	SH30071.03	Происхождение в США
Набор бусин для компенсации общего антитела AbC	Thermo Fisher Scientific	А10497	Многовидовые Ig
Нейробазальная среда	Thermo Fisher Scientific	21103049	Добавляйте сыворотку в среду перед посевом.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	Солевой раствор
Диссекционный микроскоп	Олимп	Модель SZ-PT	Стереомикроскоп
Центрифуга Sorvall	Термо Сайентиал	СТ 16Р	Все центрифугирование выполнено в RT
Опорная плита – поддон для препарирования	Научный центр Фишера	SB15233FIM	Также можно использовать восковую пластину
щипцы	Эскулап	5002-7	4 1/2 дюйма
Ножницы с радужной оболочкой, прямые	Эскулап	1360	5 1/2 дюймов
Falcon 15 мл конические пробирки	Научный центр Фишера	352097	Полипропиленовые трубки
Falcon 50 мл конические пробирки	Научный центр Фишера	352098	Полипропиленовые трубки
Трубки BD FACS	Научный центр Фишера	352003	Полипропиленовые трубки
Тарелки 40 мм	МидСайд	TP93040	Обработанная культура тканей
Нейлоновое ситечко 70 μм	МидСайд	70ИКС	стерильный
Нейлоновое ситечко 40 μm	МидСайд	40ИКС	стерильный
BD 10 мл шприц	Научный центр Фишера	301604	Одноразовый шприц без иглы
Пестики	МидСайд	вредитель	стерильный
Флаконы с Уитоном	Научный центр Фишера	986734	Без вкладыша
Игла BD 30 G	Научный центр Фишера	305128	1 дюйм
Стеклянная счетная камера Hausser Scientific Bright-Line	Научный центр Фишера	0267151Б	Гемоцитометр
Gibco Трипан синий 0,4% раствор	Научный центр Фишера	15250061	Жизнеспособность красителя
Трубки Eppendorf	Научный центр Фишера	Тел.: 05-402-25	1,5 мл
Визуализация флоидных клеток EVOS	Thermo Fisher Scientific	447113	Флуоресцентная визуализация с 20-кратным объективом
100% этанол	Научный центр Фишера	Тел.: 04-355-452	Используется для производства 70% этанола
Пипетка Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	Райнин	17014282	Пипетка LTS
Пипетка Pipet-Lite LTS L-200XLS+	Райнин	17014391	Пипетка LTS
Пипетка Pipet-Lite LTS L-20XLS+	Райнин	17014392	Пипетка LTS
Штатив LTS 1000 мл – GPS-L1000S	Райнин	17005088	Стерильные наконечники Blue Raft
Стойка LTS 250 мл – GPS-L250S	Райнин	17005092	Стерильные наконечники Green Cart
Штатив LTS 20 мл – GPS-L10S	Райнин	17005090	Стерильные наконечники для красной решетки
Сортировщик клеток FACSAria II	BD Biosciences	Н/Д	Индивидуальный заказ
Цитометр LSR II	BD Biosciences	Н/Д	Индивидуальный заказ

г.