$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, фибробласты были перепрограммированы на iPSC с помощью генетического перепрограммирования на основе мРНК. ИПСК содержали в среде стволовых клеток (SCM) (см. список материалов) и хранили при плотности ~1,2 x 102 клеток/мл с 1 мл SCM, 10 мкМ с rho-ассоциированным ингибитором протеинкиназы (ROCKi) Y-27632 и 10% (v/v) диметилсульфидом (DMSO) в криоконсервированных флаконах в жидком азоте при -160 °C. Все нижеперечисленные процедуры выполняются в шкафу биобезопасности, если не указано иное.
1. Разбавление матрицы базальной мембраны и покрытие пластин
- Разбавленная (1:50) матрица базальной мембраны с уменьшенным фактором роста, очищенная от опухоли Энгельбрета-Холма-Роя в модифицированной орлиной среде Дульбекко (DMEM) без фенолового красного.
- Покройте планшеты для клеточных культур соответствующим количеством разбавленной матрицы базальной мембраны (т.е. 6-луночный планшет = 1 мл, 12-луночный планшет = 0,5 мл) и инкубируйте эти планшеты при 37 °C в течение не менее 1 часа.
2. Поддержание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное слияние на лунку в 6-луночной пластине с плоским дном составляет ~1,2 x 106 ячеек.
- Разморозьте криоконсервированные иПСК в SCM с 10 мкМ Y-27632 и наложите на 6-луночный планшет, покрытый матрицей базальной мембраны с уменьшенным фактором роста.
- Поддерживайте уровень иПСК в SCM с 10 мкМ Y-27632 в течение первых 24 часов после размораживания. Переключитесь на свежую среду через 24 часа.
- Поддерживайте iPSCs в SCM до тех пор, пока клетки не достигнут 80-90% конфлюенции перед пассированием.
- Рассчитайте, сколько иПСК потребуется для дифференцировки, умножив желаемую плотность для дифференцировки (15 600 клеток/см2) на площадь поверхности лунки. Для планшета с плоским дном на 6 лунок умножьте 15 600 клеток/см2 на 9,6см2, чтобы получить в общей сложности 149 760 клеток/лунку.
- Для прохождения промойте клетки сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBBS). Затем инкубируйте клетки с неферментативной этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (см. список материалов) в течение 5 минут при 37 °C.
- С помощью скребка для ячеек аккуратно снимите ячейки. Соберите клетки в свежих SCM.
- Пластинчатые клетки на планшетах для клеточных культур, покрытых разбавленным SCM, и поддерживают клетки, как описано на шаге 2.3, или хранят их при концентрации ~1,2 x 106 клеток/мл в 1 мл SCM, 10 мкМ Y-27632 и 10% ДМСО (v/v) в криоконсервированных флаконах в жидком азоте при температуре -160 °C.
3. Дифференциация iPSC в BMEC
ПРИМЕЧАНИЕ: Неферментативный ЭДТА разделяет клетки на сгустки. Ферментативная ЭДТА (см. Таблицу материалов) разделяет клетки на одноклеточную суспензию. Ретиноевая кислота (РА) должна быть защищена от света.
- Промойте иПСК один раз фосфатным буферным раствором Дульбекко (DPBS). Инкубируйте с ферментативным ЭДТА (1 мл для 6-луночного планшета, 0,5 мл для 12-луночного планшета и 0,25 мл для 24-луночного планшета) в течение примерно 5 минут при 37 °C до получения одноклеточной суспензии.
- Соберите ячейки и центрифугируйте при 300 x g (относительная центробежная сила) в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточные гранулы в SCM, содержащем 10 мкМ Y-27632.
- Определите плотность клеток с помощью Trypan Blue и автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Пластинчатые ячейки плотностью 15 600 клеток/см2 или 149 760 ячеек/лунку 6-луночного планшета с плоским дном (с площадью поверхности 9,6 см2/лунку) в SCM, содержащей 10 мкМ Y-27632 в течение 24 часов.
- Начните дифференцировку через 24 часа, изменив SCM на среду E6. Меняйте носитель E6 ежедневно в течение следующих 4 дней.
- На 4-й день дифференцировки замените среду Е6 на среду без эндотелиальной сыворотки крови человека (hESFM) с добавлением разбавленной (1:200) добавки B27, 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 10 мкМ РА. Не меняйте этот носитель в течение следующих 48 часов.
- Приготовьте 200 мл hESFM с разведенным (1:200) B27, смешайте 1 мл 50x концентрированной добавки B27 с 199 мл hESFM.
- Приготовьте 20 нг/мл bFGF, восстановив 50 мкг bFGF в 250 мкл трис-буфера (5 мМ Трис, pH 7,6, 150 мМ хлорида натрия, NaCl) с получением 200 мкг/мл стокового раствора. Приготовьте 200 мл hESFM, содержащего 20 нг/мл bFGF, смешав 20 мкл 200 мкг/мл bFGF с 200 мл hESFM.
- Приготовьте 10 мкМ РА, предварительно приготовив 40 мг/мл исходного раствора РА, добавив 2,5 мл ДМСО к 100 мг порошка РА. Разбавьте эту концентрацию до 3 мг/мл до получения 10 мМ исходного раствора. Приготовьте 200 мл hESFM, содержащего 10 μM RA, смешав 200 μL 10μM RA с 200 мл hESFM.
4. Покрытие коллагена IV (COL4) и матрицы фибронектина (FN) для очистки BMEC, полученного из iPSC
- Добавьте 2 мл стерильной воды к 2 мг FN до получения 1 мг/мл исходного раствора FN. Добавьте 5 мл стерильной воды к 5 мг COL4, чтобы получить 1 мг/мл исходного раствора COL4.
- Дайте FN раствориться не менее 30 минут при 37 °C, а COL4 раствориться при комнатной температуре.
- Раствор ФН развести в стерильной воде до конечной концентрации 100 мкг/мл и в исходном растворе COL4 до конечной концентрации 400 мкг/мл.
- Покройте нужные планшеты (6-луночный планшет = 1 мл раствора COL4/FN, 12-луночный планшет = 0,5 мл, 24-луночный планшет = 0,25 мл и 12-луночный фильтрованный планшет = 0,25 мл) смесью 400 мкг/мл COL4 и 100 мкг/мл FN.
- Инкубируйте планшеты не менее 2 часов или в течение ночи при температуре 37 °C; для отфильтрованных планшетов Transwell рекомендуется минимум 4 часа.
5. Субкультура и очистка BMEC, полученных от iPSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с ферментативным ЭДТА может занять дольше 15 минут в зависимости от слияния клеток на 6-й день дифференцировки.
- На 6-й день дифференцировки дважды промыть клетки DPBS. Инкубировать с 1 мл ферментативной ЭДТА в течение не менее 15 минут при 37°C до получения одноклеточной суспензии.
- Соберите клетки с помощью центрифугирования при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточные гранулы свежими hESFM с разбавленной (1:200) добавкой B27, 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ РА.
- Затравочные клетки на планшетах, покрытых смесью 400 мкг/мл COL4 и 100 мкг/мл FN. Затравочные клетки используют соотношение 1 лунка 6-луночного планшета к 3 лункам 12-луночного планшета, 3 лункам 12-луночного фильтрованного планшета или 6 лункам 24-луночного планшета.