$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Настройка материала
- Инкубируйте куриные яйца в коммерчески доступном настольном инкубаторе для яиц при температуре 37 °C. Инкубируйте яйца в течение 7 дней для эмбрионов E7.
- Подготовка многоэлектродных матриц (MEA). Стерилизуйте необходимое количество МЭА, замочив их в 70% этаноле на 3-4 ч, а затем трижды промыть примерно в 10 мл стерильной дистиллированной воды в вытяжке уровня биобезопасности-II (BSLII).
заметка: MEA содержат 64 нанопористых платиновых электрода, расположенных в сетке 8 x 8. Диаметр электродов составляет 30 мкм, а расстояние между электродами — 200 мкм. Не используйте денатурированный этанол для стерилизации МЭА, так как это приведет к коррозии.
- Поместите МЭА в стерильный контейнер с крышкой (для поддержания стерильных условий) и переместите в настольный инкубатор. Выпекать не менее 6 часов при температуре 55 °C. Этот этап имеет решающее значение для правильной стерилизации, а температура не должна превышать 60 °C. Для сохранения стерильности переместите посуду с МЭА в вытяжку BSLII для хранения до дальнейшего использования.
заметка: Мы используем безопасную для духовки стеклянную форму для запекания с пластиковой крышкой, стерилизуем поверхность 70% этанолом и помещаем в вытяжку BSLII для сушки.
- Аликвота раствора внеклеточного матрикса (ВКМ). Разморозьте флакон при 4 °C на ночь и заморозьте 100 μL аликвот при -20 °C.
заметка: ECM поставляется в замороженном виде. Его не следует доводить до комнатной температуры до тех пор, пока он не будет готов к нанесению покрытия, так как он полимеризуется при комнатной температуре и его невозможно покрыть после полимеризации. ЭКМ без факторов роста предпочтительна для предотвращения дополнительных эффектов из-за неизвестных факторов.
- Стерилизуйте все инструменты для вскрытия (щипцы Dumont #5, изогнутые щипцы, маленькие ножницы и пружинные ножницы) и самоуплотняющиеся посуды для препарирования с покрытием из материала с 70% этанолом и дайте им высохнуть в капюшоне.
2. Культура эмбриональных нейронов цыплят и сетевая активность
- В день нанесения покрытия достаньте флакон ECM из морозильной камеры при температуре -20 °C, распылите 70% этанола и положите его на лед. Разбавить до 25% путем добавления 300 мкл холодной нейробазальной среды внутрь капюшона BSLII.
- С помощью пипеттометра P200 добавьте 100 мкл 25% ECM в центр MEA, стараясь не касаться электродов, и немедленно удалите, оставив тонкую пленку на поверхности. Накройте МЭА крышкой и поместите в инкубатор сСО2 (37°C и 5%СО2) до готовности к пластинированию нейронов.
- Стерилизовать внешнюю оболочку яйца Е7 (эмбриональный день 7, инкубация при 37 °C в течение 7 дней) 70% этанолом. Обезглавьте эмбрион в донную чашку Sylgard, содержащую холодный стерильный раствор сбалансированных солей Хэнка (HBSS) без кальция. Разрежьте вокруг глаз и удалите глазные яблоки. С помощью тонких щипцов DuMont #5 и пружинных ножниц сделайте разрез на вентральной стороне и удалите внешние слои кожи, чтобы обнажить передний мозг и зрительный тектум. Осторожно очистите и снимите пиальную мембрану. Перенесите передний мозг в другую чашку Петри и разрежьте ее на небольшие кусочки размером около 2 мм пружинными ножницами.
заметка: После удаления пиальной оболочки к переднему мозгу не должно быть никаких кровеносных сосудов. Если это возможно, предпочтительно проводить вскрытие в стерильном капюшоне, хотя мы получили довольно хорошие результаты, когда вскрытие проводится вне капюшона, при условии, что инструменты и область вскрытия тщательно стерилизованы 70% этанолом.
- С помощью стерильной пипетки соберите кусочки переднего мозга в центрифужную пробирку объемом 15 мл и удалите как можно больше HBSS, дав им опуститься на дно центрифужной пробирки.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсина/этилендиамина тетрауксусной кислоты (трипсин/ЭДТА) (предварительно подогретую до 37 °C) и выдерживайте при 37 °C в течение 15 минут.
- С помощью пастеровской пипетки осторожно удалите трипсин, не потревожив кусочки ткани, и добавьте 1 мл нейробазальной среды. Дайте кусочкам ткани опуститься на дно и удалите среду. Повторите эту стирку еще раз. Этот шаг предназначен для смывания трипсина/ЭДТА.
- Добавьте 2 мл нейробазальной среды и начните тритуризацию. Растирание включает в себя взятие стерильной отполированной огнем пипетки Пастера и осторожное прохождение через нее ткани несколько раз, пока не исчезнут кусочки. Если после повторных проходов остались кусочки, просто оставьте их оседать на дно.
заметка: Избегайте вспенивания во время растирания - если пена все же образуется, остановитесь и удалите с помощью аспирации.
- Разведите ресуспензированные клетки в соотношении 1:10 с нейробазальной средой и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью красителя Trypan Blue и гемоцитометра. Смешайте 50 мкл разведенных ячеек с 50 мкл раствора Trypan Blue в центрифужной пробирке объемом 0,5 мл. Добавьте 10 μL в гемацитометр после установки на покровную крышку и подсчитайте яркие прозрачные клетки (синие клетки мертвые и их не следует считать).
заметка: Типичное количество клеток из одного оптического тектума E7 колеблется от 1 до 5 x 10 7 клеток/мл.
- Пластины диссоциированных ячеек на МЭА с покрытием ECM с плотностью 2200 клеток/квадратный мм. Для нашей системы MEA это составляет примерно 130 000 ячеек на MEA. Добавьте нейробазальную среду, чтобы довести объем МЭА до 1 мл, и поместите МЭА в инкубатор CO2 на ночь для прикрепления клеток и удлинения нейритов (рис. 1).
заметка: Для MEA с разной площадью и количеством электродов можно попробовать различную плотность клеток - в целом, более высокая плотность клеток приводит к большей активности сети, но также приводит к более короткоживущим культурам.
