$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Генерация нейронных клеток-предшественников (iNPC), полученных из iPSC)
- Производите EZ-сферы из колоний iPSC, как описано ниже и как было опубликовано ранее.
- Культивирование колоний iPSC до конфлюенции на 6-луночных планшетах с покрытием из базальной мембраны (0,5 мг/планшет) в mTESR1 или других коммерческих средах (см. Таблицу материалов).
- Удалите среду iPSC и замените 2 мл среды EZ-сферы [ESM; DMEM:F12 7:3 с добавлением 100 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 100 нг/мл эпидермального фактора роста, 5 мкг/мл гепарина и 2% добавки B27].
- Соскребите дно каждой конфлюентной лунки тыльной стороной стерильного наконечника для пипетки объемом 1000 мкл или скребка для клеток.
- Соберите все ячейки и поместите их в колбу T25 со сверхнизким уровнем крепления, чтобы обеспечить спонтанное образование свободно плавающих сфер. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
- Подкармливайте сферы каждые 2–3 дня, когда среда станет желтой, заменяя половину среды свежей ЭСМ. Это позволяет сферам оставаться в кондиционированной среде, что очень важно для их роста и поддержания.
- Поставьте колбу на решетку для труб и дайте сферам осесть под действием силы тяжести в течение 1–2 минут до угла колбы.
- После отстаивания аспирируйте половину надосадочной жидкости с помощью серологической пипетки объемом 5 мл или 10 мл и замените ее свежей, предварительно подогретой СОЭ.
- Еженедельно проходите через EZ-сферы, измельчая сферы до диаметра 200 мкм, как описано ранее. EZ-сферы могут поддерживаться до 25 проходов и идеально подходят для использования между 8–25 проходами.
- Готовят одноклеточную суспензию iNPC:
- Чтобы индуцировать нейронную дифференцировку, диссоциируйте EZ-сферу на отдельные клетки.
- Соберите шарики через 3–4 дня после измельчения из колбы T75 и переложите их в коническую форму объемом 15 мл, затем дайте постоять 2 минуты или пока все шарики не осядут на дно.
- Медленно удаляйте ЭСМ с помощью пипетки объемом 5 мл, не нарушая осевшие сферы. Добавьте 1 мл диссоциативного раствора (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C.
- Взбейте диссоциативный раствор и сферы после 5 минут инкубации, чтобы убедиться, что все осевшие сферы обработаны.
- Медленно удалите раствор диссоциации. Добавьте 1 мл среды нейронной дифференцировки [NDM; DMEM: F12 с 2% B27 минус витамин A, 1% добавка N2 и нейротрофический фактор мозга человека (hBDNF, 20 нг/мл)].
- Растирайте сферы в отдельные ячейки с помощью пипетирования с помощью пипетки объемом 1 мл, а затем пипетки объемом 200 мкл, пока все сферы не диссоциируют. Избегайте образования пузырей во время процедуры растирания.
- Подсчитайте диссоциированные клетки с помощью гемоцитометра и разбавьте клетки до конечной плотности 1 x 106 клеток/мл. Возможно изменение плотности в зависимости от области применения.
заметка: Более высокие плотности (до 6 x 106 клеток/мл) рекомендуются для кратковременного посева культур до 3 дней, а более низкие плотности рекомендуются для долгосрочного применения до 3 недель><.
заметка: Теперь клетки готовы к затравке в верхний канал чипа, чтобы сформировать «мозговую сторону».
2. Дифференциация iPSC в iBMEC
- Прохождение iPSC из одной сливающейся лунки 6-луночного планшета в соотношении 1:6 в 6-луночный планшет с матричным покрытием фундаментальной мембраны. Дайте ячейкам прилипнуть в течение 24 ч. Меняйте среду iPSC ежедневно.
- Ежедневно подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Когда клетки достигают плотности 1,5–3,0 x 105 клеток/лунку, замените среду iPSC на 3 мл некондиционированной среды без bFGF [DMEM:F12 1:1, с 10% нокаутирующей заменительной сывороткой (KOSR), 1% заменимых аминокислот (NEAA), 0,5% добавкой глутамина (Таблица материалов) и 100 мкМ β-меркаптоэтанола]. Заменяйте средство ежедневно в течение 6 дней.
- На 6-й день замените среду средой эндотелиальных клеток (ЭК) [свободная среда эндотелиальной сыворотки крови человека (hESFM) с добавлением 1% бедной тромбоцитами плазменной сыворотки крупного рогатого скота, 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (РА)]. Оставьте средство на 2 дня.
- Удалите EC-среду и добавьте 1 мл диссоциационного раствора на лунку. Инкубировать при 37 °C в течение 35 мин.<бр/>
заметка: Несмотря на то, что это считается длительным временем инкубации в используемом здесь растворе для диссоциации, iBMEC могут выдерживать эту обработку с жизнеспособностью клеток выше 90%.
- Отделите клетки от лунки, аккуратно пипетируя клеточную суспензию и собирая все клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
заметка: Избегайте резкого пипетирования. Если клетки не отделяются легко, инкубируйте еще 5 минут.
- Добавьте 1 объем ЕС-среды к 15 мл конической конуса для инактивации аккутазы, центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин, удалите среду и замените ее 1 мл EC-среды (без bFGF и RA).
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и отрегулируйте плотность клеток до 14–20 x 106 клеток/мл.<бр/>
заметка: Теперь клетки готовы к посеву в нижний канал чипа для формирования «кровавой стороны».
3. Микропроизводство органного чипа
- Используйте органный чип для модели чипа BBB и его производства, как это было сделано ранее. Органный чип с высоким каналом (см. Таблицу материалов) изготовлен из высокоэластичного полидиметилсилоксанового (PDMS) эластомера, который содержит два наложенных друг на друга параллельных микромасштабных канала, разделенных гибкой пористой мембраной. Размеры верхнего и нижнего микроканалов составляют 1 мм x 1 мм и 1,0 мм x 0,2 мм соответственно. Два канала разделены гибкой пористой мембраной толщиной 50 мкм, изготовленной методом PDMS, содержащей поры диаметром 7 мкм с расстоянием 40 мкм. Площадь поверхности пористой мембраны, разделяющей каналы, составляет 0,171 см2 .
4. Подготовка стружки
- Органические чипы поставляются в предварительно упакованном виде в держателе для чипов, что устраняет необходимость нарушать или искажать выравнивание чипа во время работы. Кроме того, держатель чипа надежно подключается к портативному модулю («Pod»), который действует как интерфейс между модулем культуры и чипом.
- Распылите на упаковку чипсов 70% этанола и занесите их в шкаф биобезопасности (БСК).
- Откройте упаковку и выложите чип органа в стерильную чашку Петри. Держите держатель стружки только по бокам, чтобы избежать прямого контакта со стружкой.
- Убедитесь, что язычок держателя направлен вправо (рис. 1), а при использовании нескольких микросхем выровняйте их все в одной ориентации.
- Пометьте каждую стружку на вкладке носителя (полная подготовка стружки и рабочий процесс показаны на рисунке 2).
5. Активация поверхности и покрытие ECM
- Приготовление раствора для поверхностной активации
- Эмулятивный реагент 1 (ЭР-1), входящий во флакон с дозой 5 мг, светочувствительный. Готовьте свежий раствор ЭР-1 непосредственно перед применением. Целостность ER-1 имеет решающее значение для успешной подготовки чипов.
- Выключайте свет в БСК при работе с ER-1.
заметка: ER-1 является раздражителем для глаз, и с ним следует работать в BSC в надлежащих перчатках и защитных очках.
- Перед использованием дайте реагентам ER-1 и ER-2 сбалансироваться до комнатной температуры (RT).
- Защитите раствор от света, обернув пустую стерильную коническую пробирку объемом 15 мл фольгой.
- В BSC кратковременно постучите по флакону ER-1, чтобы порошок осел на дне.
- Добавьте во флакон 1 мл буфера ER-2 и немедленно переложите его содержимое на дно конической пробирки, обернутой объемом 15 мл. Не перемешивайте пипеткой. Цвет раствора, перенесенного на коническую трубку, будет красным.
- Повторите шаг 5.1.6 3 раза. На последнем круге закройте флакон ER-1 крышкой и переверните, чтобы собрать остатки порошка с крышки, затем перелейте раствор в коническую пробирку; Это позволит довести общий объем до 4 мл раствора ЭР-1.
- Добавьте 6 мл раствора ER-2 к 4 мл раствора ER-1 в конической пробирке объемом 15 мл до конечной концентрации 0,5 мг/мл. ER-1 должен быть полностью растворен в растворе ER-2.
- Поверхностная активация
- Используя пипетку P200 и стерильный наконечник для пипетки с фильтром объемом 200 мкл, возьмите 200 мкл смеси ER-1.
- Поместите пипетку в нижнее входное отверстие и протолкните 20 μL смеси ER-1 через нижний канал до тех пор, пока смесь не начнет вытекать из нижнего выходного отверстия.
- Добавьте примерно 50 мкл смеси ER-1 и поместите ее в верхнее входное отверстие канала. Протолкните смесь через верхний канал до тех пор, пока она не начнет вытекать из выходного отверстия верхнего канала.
- Удалите все излишки смеси ER-1 с поверхности чипа с помощью легкой аспирации. Убедитесь, что смесь ER-1 удаляется только с поверхности стружки, а не из каналов.
- Перед активацией ультрафиолета (УФ) убедитесь, что в каналах нет пузырьков воздуха. При обнаружении пузырьков воздуха удалите пузырьки, промыв канал смесью ЭР-1.
- Поместите открытую чашку с чипсами в коробку с ультрафиолетовым излучением (предоставленную Emulate Inc.).
- Установите переключатель в задней части короба УФ-света в положение «Постоянно». Включите питание и инициируйте активацию ультрафиолета. Оставьте чипсы под ультрафиолетовым светом на 20 мин.<бр/>
заметка: Избегайте воздействия ультрафиолетового излучения на персонал.
- Удалите смесь ER-1 из обоих каналов.
- Промойте каждый канал 200 μл раствора ER-2.
- Отключите ER-2 от обоих каналов.
- Промойте каждый канал 200 μЛ стерильного холодного фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
- Оставьте холодные DPBS внутри каналов до перехода к следующему этапу.
- Подготовка и нанесение покрытия на внеклеточный матрикс (ВКМ)
- Приготовьте решение ECM, соединив отдельные компоненты ECM с холодным DPBS, водой или другим растворителем до конечных рабочих концентраций. Раствор ECM следует готовить свежим при каждом использовании.
- Покрыть верхний и нижний каналы чипа ЭХМ, состав которого определяется типом затравливаемой ячейки. Смесь ECM необходимо выдерживать на льду до использования.
- Используйте ламинин (50 мкг/мл) для покрытия «мозговой стороны», а коллаген IV и фибронектин, смешанные в соотношении 4:1 (320:80 мкг/мл), чтобы покрыть «кровь», как описано в разделе 5.6.
- Приготовление аликвот ECM
- Развести ламинин 1 мг/мл в холодном DPBS до конечной концентрации 50 мкг/мл. Аликвоту и хранить при температуре -20 °C до использования.
- Растворите коллаген в/в в 0,1% уксусной кислоте до концентрации 1 мг/мл. Раствор инкубировать при температуре 2–8 °C в течение ночи или при RT в течение 1–3 ч или до полного растворения.
- Приготовьте смесь коллагена IV:фибронектин объемом 1 мл (320 мкл коллагена IV, 80 μл фибронектина, 600 μл стерильного H2O двойной дистилляции). Смесь можно хранить при температуре -20 °C.
- Нанесение покрытия на стружку с помощью ECM
- Полностью аспирируйте холодный DPBS из обоих каналов. Установите пипетку P200 так, чтобы она принимала 100 μл коллагена IV:раствор фибронектина.
- Вводите раствор через входное отверстие нижнего канала до тех пор, пока на выходном отверстии не образуется мелкая капля. Оставьте небольшую каплю на входе после снятия наконечника пипетки.
- Вводите раствор ламинина через входное отверстие верхнего канала до тех пор, пока на выходе не образуется небольшая капля. Оставьте небольшую каплю на входе после снятия наконечника пипетки.
- Внимательно осмотрите каналы, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков. Если пузырьки присутствуют, промойте канал соответствующим раствором ECM до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены.
- Повторите шаги 5.5.1–5.5.4 для каждой микросхемы.
- Добавьте 1,5 мл DPBS в колпачок конической пробирки объемом 15 мл. Поместите колпачок DPBS в чашку для культуры диаметром 150 мм вместе со стружкой, чтобы обеспечить дополнительную влажность, и закройте чашку парапленкой. Для достижения наилучших результатов инкубируйте чипсы при температуре 4 °C в течение ночи.
заметка: При желании, клетки могут быть засеяны в тот же день, что и активация чипа и покрытие ECM, хотя предпочтительна ночная инкубация. Щепа может быть готова к посеву через 4 ч после добавления ECM и инкубации щепы при 37 °C.
6. Засеиваем канал "мозговой" стороны и дифференцируем EZ-сферы в смешанные нейронные культуры
- Поднесите блюдо, содержащее подготовленные чипсы, к БСК. Аккуратно промойте оба канала 200 μл NDM.
- Избегая контакта с портами, осторожно отсасывайте лишние капли среды с поверхности чипа. Осторожно перемешивайте клеточную суспензию перед посевом каждой микросхемы, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию
- Загрузка iNPC в верхний канал для генерации «мозговой стороны»
- Засейте ячейки (1 x 106 клеток/мл) в верхний канал чипа. Добавьте наконечник P200, содержащий 30–100 μл клеточной суспензии, к входу в верхний канал и осторожно освободите наконечник от пипетки. Возьмите пустую пипетку P200, нажмите на поршень, вставьте его в выходное отверстие верхнего канала и осторожно протяните одноэлементную суспензию через чип.
- Накройте чашку крышкой и перенесите в микроскоп, чтобы проверить плотность затравки и равномерное распределение клеток в верхнем канале. Аккуратно извлеките наконечник пипетки из входного и выпускного отверстий чипа.
- Плотность заделки семян должна проявляться как 20% охвата. Если плотность посева выше или ниже ожидаемой или неравномерна, верните стружку в BSC, промойте канал 2 раза 200 μL свежей среды и повторите шаг 6.3.1.
- После подтверждения правильной плотности ячеек немедленно поместите чипсы в инкубатор на 2 ч при температуре 37 °C после посева каждой партии чипсов. Ячейки, которые не прикрепляются, смойте свежим NDM.
- Выдерживайте клетки в статических условиях при температуре 37 °C с ежедневной заменой NDM не менее 48 часов до начала потока. iBMEC можно высевать после прикрепления iNPC или на следующий день после посева iNPC.
7. Посев iBMEC в нижний канал для генерации "кровавой стороны"
- Поднесите блюдо, содержащее подготовленные чипсы, к БСК. Аккуратно промойте нижний канал 200 μл EC среды.
- Избегая контакта с портами, осторожно отсасывайте капли излишков EC-среды с поверхности чипа, стараясь оставить среду в обоих каналах. Осторожно перемешивайте клеточную суспензию перед посевом каждой микросхемы, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию.
- С помощью пипетки P200 наберите 30–100 мкл клеточной суспензии iBMEC (14–20 x 106 клеток/мл) и поместите наконечник во входное отверстие нижнего канала. Аккуратно отсоедините наконечник от пипетки, оставив наконечник, содержащий ячейки, во входном отверстии.
- Нажмите на поршень пипетки P200 с пустым наконечником, вставьте в выходное отверстие нижнего канала и осторожно протяните одноэлементную суспензию через нижний канал, медленно отпуская поршень пипетки.
- Отсасывайте лишнюю клеточную суспензию с поверхности чипа. Избегайте прямого контакта с входным и выпускным отверстиями, чтобы гарантировать, что суспензия элементов не будет высасываться из каналов.
- Накройте чип и перенесите его в микроскоп, чтобы наблюдать за плотностью затравки. Нижний канал должен быть заполнен без видимых промежутков между клетками при наблюдении в 4x или 10x под микроскопом (рис. 3).
- Если плотность посева ниже 90% покрытия или распределена неравномерно, отрегулируйте плотность ячеек соответствующим образом и повторяйте шаги 7.2–7.6 до тех пор, пока не будет достигнута правильная плотность в канале. После подтверждения правильной плотности клеток (рисунок 3), засеиваются клетки в оставшиеся чипы. Чтобы прикрепить клетки к пористой мембране, которая расположена в верхней части нижнего канала, переверните каждую микросхему и положите ее в подставку для чипов.
- Поместите небольшой резервуар (коническую крышку пробирки объемом 15 мл, содержащую стерильный DPBS) внутрь чашки диаметром 150 мм, чтобы обеспечить влажность клеток. Инкубируйте чипсы при 37 °C в течение примерно 3 ч или до тех пор, пока не прикрепятся клетки в нижнем канале. После того, как iBMEC прикрепятся (~3 часа после посева), верните чипсы обратно в вертикальное положение, чтобы обеспечить прикрепление ячеек к нижней части нижнего канала.
8. Начало потока
- Поток обычно инициируется через 48 часов после посева iBMEC. Это время требуется для того, чтобы iBMEC прочно прикрепились к чипу.
- Для поддержания ламинарного потока через чип важно дегазировать и уравновешивать температуру среды. Среду необходимо предварительно прогреть на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 ч.
- До 50 мл подогретой среды может быть дегазировано путем инкубации в вакуумной системе фильтрации в течение 15 минут.
- Грунтовка переносных модулей
- Продезинфицируйте внешнюю поверхность упаковки портативного модуля и лотков с 70% этанолом, протрите и передайте в BSC. Откройте упаковку и поместите модули в лоток. Расположите их вместе с резервуарами к задней части лотка.
- Пипетка подает 3 мл предварительно уравновешенной, теплой среды в каждый входной резервуар. Добавьте питательную среду EC во входной резервуар нижнего канала и NDM в входной резервуар верхнего канала верхнего канала (рис. 4).
- Пипетка объемом 300 мкл предварительно уравновешенной теплой среды подается в каждый выходной резервуар непосредственно над каждым выходным отверстием (рис. 4).
- Разместите до шести портативных модулей на каждом лотке. Поднесите лотки к инкубатору и полностью вставьте их в модуль культивирования ручкой лотка наружу.
- Выберите и запустите цикл "Prime" в модуле культуры. Закройте дверцу инкубатора и дайте модулю культуры подготовить портативные модули (требуется ~1 минута). Цикл грунтовки завершается, когда в строке состояния отображается сообщение «Готово». Извлеките лоток из модуля культуры и поднесите его к ДСК.
- Убедитесь, что портативные модули были успешно заправлены, осмотрев нижнюю часть каждого портативного модуля в BSC. Ищите наличие мелких капель на всех четырех портах.
- Если какой-либо портативный модуль не показывает капли, повторите цикл prime на этих модулях. Если на лоток капнул носитель (чаще всего это может происходить через выпускные отверстия), очистите лоток 70% этанолом.
- Подключение чипов к портативным модулям, регулирование и инициирование потока
- Аккуратно промойте оба канала каждого чипа теплой, сбалансированной питательной средой, специфичной для клеток, чтобы удалить любые возможные пузырьки в канале, и поместите небольшие капли среды (в зависимости от среды в канале) на верхнюю часть каждого входного и выходного отверстий.
- Вставьте чипы с носителями в портативные модули и разместите до шести на каждом лотке. Вставьте лотки в модуль культуры. Запрограммируйте соответствующие условия культивирования чипов органов (скорость потока и растяжение) на модуле культивирования.
- Запрограммированные условия начнутся, как только завершится цикл "Регулирование".
заметка: Расход для каждого канала может регулироваться независимо и может быть установлен в диапазоне от 0 до 1 000 мкл/ч. Чип BBB обычно культивируется со скоростью 30 мкл/ч. При работе с протекающими средами, такими как ЕС-фильтрующие материалы или ЭСМ, со скоростью 30 мкл/ч и 1000 мкл/ч, силы сдвига составляют 0,01 дин/см2 и 0,33 дин/см2 соответственно.
- Запустите цикл «Регулирование», который занимает примерно 2 часа, после чего модуль культуры начнет протекать при заданных условиях культивирования чипа органа.
