$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Микродиссекция дорсолатерального конечного мозга
- Приготовьте среду для вскрытия (100 мл): 98,5 мл сбалансированного раствора соли Хенка (HBSS), 0,5 мл 5 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) pH 7,4, 1 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 μг/мл).
- Процедить-простерилизовать диссекционную среду.
- Извлеките эмбрионы 14-го дня (E14) от беременной мыши C57/Bl6 (Mus musculus) под наркозом изофлурана.
заметка: Рассматривайте E0 как день обнаружения вагинальной пробки. Вскрытие должно быть завершено не позднее 1 ч после удаления от беременной мыши. Этот протокол также распространяется на эмбрионы Е11-Е17.
- Извлеките эмбрионы методом гистерэктомии в стерильных условиях.
- Перенесите эмбрионы в чашку Петри с холодной средой для препарирования (4 °C).
- Удалите мозги из черепа, разрезав вдоль продольной щели. Количество эмбрионов обычно варьируется от пяти до десяти. Каждый мозг E14 дает примерно 2 x 106 клеток, включая предшественников и постмитотические нейроны (соотношение 1:1)
заметка: Используйте стереомикроскоп для выполнения следующих действий.
- Удалите мозговые оболочки с помощью щипцов для рассечения. Разделите конечный мозг посередине, чтобы отделить полушария. Чтобы изолировать дорсолатеральный конечный мозг, разрежьте вдоль дорсомедиальной кривой и паллиально-субпаллиальной границы с помощью щипцов для рассечения. Перенесите дорсолатеральный конечный мозг в трубку объемом 2 мл со средой для холодной диссекции (4 °C) до тех пор, пока не будут рассечены все мозги.
2. Диссоциация и покрытие клеток
- Приготовьте пролиферирующую среду (50 мл DMEM + 10% FCS): 44 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), 5 мл сыворотки для телят плода (FCS), 0,5 мл 40% глюкозы, 0,5 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 μг/мл). Отфильтруйте и простерилизуйте пролиферативную среду.
- Готовят среду для дифференцировки (50 мл DMEM + 2% B27): 48 мл DMEM, 1 мл B27, 0,5 мл 40% глюкозы, 0,5 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 μг/мл). Фильтруем-стерилизуем дифференцировочную среду.
- После микродиссекции дорсолатерального конечного мозга у мышей Е14 пробирку центрифугируют с собранной тканью и средой для холодной диссекции (в течение 5 мин при 4 °С, 340 х г) для осаждения ткани.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и добавьте 1 мл предварительно подогретой (37 °C) трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,05%) для химического переваривания. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C. Добавьте 2 мл пролиферативной среды, чтобы остановить активность трипсина.
- Отполируйте кончик стеклянной пастеровской пипетки над газовой горелкой или горелкой Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы немного сузить отверстие. Промойте пипетку, отасунув FCS, чтобы покрыть наконечник. Во избежание образования пузырьков механически диссоциируйте клетки с помощью дозатора Пастера, отполированного огнем и покрытого FCS.
- Центрифугируйте ячейки (в течение 5 мин при 4 °C, 340 x g). Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Добавьте 1 мл пролиферативной среды и ресуспендируйте клетки с помощью пипетки. Повторите этот шаг один раз.
- Приготовьте разведение клеточной суспензии в соотношении 1:1 с использованием 0,4% раствора Трипана Синего. Нежизнеспособные клетки будут синего цвета. Используя камеру Нейбауэра, подсчитайте количество жизнеспособных клеток (неокрашенных).
- Разбавьте клетки в пролиферирующей среде до получения10-6 клеток/мл. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного тканевого культурального планшета (примерно 2,5 × 105 клеток/см2). Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2,
заметка: Не используйте стеклянные покровные стекла, так как они могут перемещаться во время эксперимента и менять поле наблюдения. В качестве альтернативы используйте планшеты для культивирования тканей со стеклянным дном.
заметка: Если вы не используете мультитарелки, обработанные клеточными культурами, важно предварительно обработать планшеты поли-D-лизином (50 мкг/мл) в течение 2 ч при 37 °C. Обработанные PDL планшеты можно хранить при температуре 4 °C после промывки дистиллированной водой.