$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы для клеточных культур должны быть приготовлены с использованием стерильных процедур в шкафу биологической безопасности и отфильтрованы на 0,2 мкм для предотвращения загрязнения.
1. Приготовление растворов и питательных сред
- Приготовьте раствор для покрытия ламинина путем разведения 20 мкл 1 мг/мл запаса ламинина в 2 мл стерильного дистиллированногоН2О. Приготовьте в день вскрытия.
- Приготовьте 10% раствор для остановки сыворотки лошадей (лошадей) (ES), добавив 5 мл ES к 45 мл 1x Сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS). Стерильный фильтр с использованием фильтрующей системы 0,2 мкм или наконечника шприцевого фильтра. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте 4% массовый раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), добавив 2 г порошка БСА к 1 фосфатно-солевому буферу (PBS) и доведя его до конечного объема 45 мл. Стерильный фильтр с использованием фильтрующей системы 0,2 мкм или наконечника шприцевого фильтра. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте исходный раствор папаина, разбавив папаин до 3 мг/мл в 1x HBSS. Стерильный фильтр с использованием фильтрующей системы 0,2 мкм или наконечника шприцевого фильтра. Хранить при температуре -20 °C.
- Приготовьте раствор дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), добавив 20 мг порошка ДНКазы к стерильномуН2Ои доведя его до конечного объема 20 мл. Стерильный фильтр с использованием фильтрующей системы 0,2 мкм или наконечника шприцевого фильтра. Хранить при температуре -20 °C.
- Приготовьте исходный раствор аскорбиновой кислоты, добавив 352 мг аскорбиновой кислоты к стерильной дистиллированной H2O и доведя его до конечного объема 20 мл. При необходимости нагрейте в бане при температуре 37 °C до полного растворения. Стерильный фильтр с использованием фильтрующей системы 0,2 мкм или наконечника шприцевого фильтра. Хранить при температуре -20 °C.
- Приготовьте питательную среду для клеточных культур, добавив в 50 мл нейробазальной среды: 500 мкл Глутамакса (100x), 500 мкл лошадиной сыворотки, 1 мл B-27, 100 мкл аскорбиновой кислоты, 500 мкл пенициллин-стрептомицина, 50 мкл канамицина и 50 мкл ампициллина. Стерильный фильтр с использованием фильтрующей системы 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте 0,01% раствор Triton X-100, добавив 1 мл Triton X-100 в 9 мл 1x PBS до получения 10% раствора. Поскольку Triton X-100 вязкий, делайте пипетку медленно, чтобы наконечник полностью заполнился. При необходимости нагрейте в бане при температуре 37 °C, чтобы раствориться. Хранить при температуре 4 °C.
- Чтобы разбавить 10% Triton X-100 до 0,01%, выполните 3 последовательных разведения 1:10. Разбавьте 1 мл 10% бульона в 9 мл 1x PBS до получения 1% раствора. Развести 1 мл 1% раствора в 9 мл 1x PBS до получения 0,1% раствора. Разведите 1 мл 0,1% раствора в 9 мл 1x PBS до получения 0,01% раствора.
- Приготовьте 10% и 1% растворы нормальной козьей сыворотки (NGS), добавив 1 мл NGS к 9 мл 1x PBS для получения 10% раствора и 100 мкл NGS к 9,9 мл 1x PBS для получения 1% раствора.
- Приготовьте стоковый раствор глутамата (100 мМ), добавив 735 мг L(+)-глутаминовой кислоты к стерильной дистиллированной H2O и доведя его до конечного объема 50 мл. Растворимость при такой концентрации будет проблемой. Для повышения растворимости достаточно добавления небольших объемов (100 μл) 1 М соляной кислоты.
- Приготовьте стоковый раствор NBQX (10 мМ), добавив 50 мг NBQX к стерильному дистиллированному H2O и доведя его до конечного объема 13 мл.
2. Приготовление посуды для культуры и покровных листочков (Сделано за день до вскрытия)
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что сочетание трех покрывающих агентов, поли-L-лизина, поли-L-орнитина и ламинина, обеспечивает идеальную адгезию и жизнеспособность клеток.
- Поместите 10 чашек Петри 35 мм в шкаф биологической безопасности. Положите в каждую форму два круглых покровных листа толщиной 12 мм и заполните 70% EtOH на 10 минут. Используйте вакуумную линию для отсасывания оставшегося этиона из каждой чашки, позволяя ему полностью испариться.
- Нанесите ~90-100 мкл 0,1% раствора поли-L-лизина на каждую покровную крышку, убедившись, что она покрыта полностью. Накройте посуду крышками и поместите в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час.
- Отасканируйте оставшийся раствор поли-L-лизина из каждого покровного стекла и промойте стерильнымH2O.
- Повторите шаги 2.2 – 2.3 с 0,1% раствором поли-L-орнитина.
- Снова повторите шаги 2,2 – 2,3 с 0,01% раствором ламинина. Поместите в инкубатор с температурой 37 °C / 5%CO2 до готовности к установке клеток на следующий день.
3. Вскрытие эмбриона мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем от 4 до 6 беременных мышей на одну культуру. Несмотря на то, что большая часть процесса вскрытия происходит за пределами шкафа биологической безопасности, по-прежнему важно поддерживать стерильную процедуру. Идеальным является обильное использование 70% EtOH на поверхностях рядом с диссекционным микроскопом и на хирургических инструментах. Во время вскрытия также можно надевать маску для дальнейшего предотвращения заражения. Кроме того, мы используем 4 отдельных антибиотика в питательной среде, поэтому заражение маловероятно. Однако, если использование антибиотиков проблематично, эту установку для вскрытия можно переместить внутрь стерильного капюшона. Для сохранения жизнеспособности клеток все диссекционные растворы должны быть предварительно охлаждены до 4 °C, а вскрытие должно быть завершено как можно быстрее. Мы не проводим вскрытия на льду. Метод вскрытия эмбриональных нейронов среднего мозга мыши идентичен ранее описанным методам.
- Подготовьте место на скамейке рядом с микроскопом для препарирования с помощью абсорбирующей прокладки и обильно распылите 70% EtOH.
- Распылите на две стеклянные чашки Петри размером 100 x 15 мм и одну стеклянную чашку Петри 50 x 10 мм с содержанием этиленоксида 70% и дайте этиленоксиду испариться. После выпаривания поместите 50 мл стерильного 1x HBSS в каждую чашку Петри размером 100 x 15 мм.
- Погрузите хирургические ножницы, щипцы и лезвие микротома в 70% EtOH минимум на 10 минут для стерилизации. Положите инструменты на впитывающую салфетку для просушки.
- Используя CO2 с последующим вывихом шейки матки, усыпьте 2-3-месячных мышей с временным временем беременности на 14-й день эмбриона.
- Опрыскайте брюшную полость усыпленных мышей 70% EtOH. С помощью щипцов захватите нижнюю часть живота и вскройте брюшную полость с помощью хирургических ножниц. Начинайте резать рядом с тем местом, где щипцы удерживают живот, делая боковые надрезы с каждой стороны до тех пор, пока брюшная стенка не будет откинута назад и матка не будет хорошо видна.
- С помощью хирургических ножниц разрежьте оба конца маточного рога. Затем удалите матку и поместите ее в чашку Петри с 1x HBSS.
- С помощью щипцов с прямым концом тщательно извлекают эмбрионы из матки. Оставляйте эмбрионы в HBSS на протяжении всего этого процесса. Используя либо щипцы, либо лезвие микротома, быстро обезглавьте эмбрионы, разрезав их возле шеи. Делаем как можно ровный срез.
- Под препарирующим микроскопом переместите головку эмбриона в сухую чашку Петри диаметром 50 мм и поместите ее на брюшную сторону. Стабилизируйте голову с помощью щипцов, поместив и проникнув рядом с глазами/мордой. Щипцы должны быть наклонены вниз под углом ~45°, чтобы избежать проникновения в мезенцефалон.
- С другой стороны, используя щипцы, осторожно удалите полупрозрачный слой кожи и черепа прямо перед выступающим гребнем заднего мозга. Начните с средней линии и удаляйте кожу и череп каудально до тех пор, пока не обнажится весь мозг.
- Держите щипцы перпендикулярно обнаженному мезенцефалону, одним кончиком которого следует находиться между корой и межмозговым мозгом, а другим – рядом с мозжечком. Надавите и сожмите щипцы вместе, чтобы удалить весь средний мозг. Толщина сегмента среднего мозга должна составлять примерно 0,5 мм. Поместите сегмент среднего мозга во вторую чашку Петри, наполненную свежим 1x HBSS. Повторите этот процесс для каждого эмбриона.
- С помощью диссекционного микроскопа расположите сегмент мозга вентральной стороной вверх. Если мозговые оболочки все еще прикреплены, осторожно удалите их, захватив щипцами и подняв вверх и в сторону от сегмента мозга.
- Сегмент мозга должен иметь 4 видимых квадранта. Расположите сегмент таким образом, чтобы два меньших квадранта располагались выше двух больших квадрантов. Имеется выступающий гребень, отделяющий два верхних (малых) квадранта от двух нижних (больших) квадрантов.
- С помощью щипцов сожмите и отделите верхние квадранты от нижних, а затем отбросьте верхние квадранты. Оставшиеся нижние квадранты будут иметь избыток ткани латерально на дорсальной стороне, эта ткань будет выглядеть менее непрозрачной, чем остальная вентральная ткань. Удалите менее плотную спинную ткань и выбросьте. Оставшийся сегмент должен содержать как Substantia nigra pars compacta (SNc), так и вентральную тегментальную область (VTA).
- С помощью щипцов разрежьте оставшийся вентральный сегмент ткани на 4 более мелкие части и с помощью пипетки с широким отверстием объемом 1 мл перенесите эти сегменты в коническую трубку объемом 15 мл с 1x HBSS. Держите коническую трубку с сегментами мозга на льду на протяжении всей процедуры.
- Повторите этот процесс для всех остальных сегментов мозга.
4. Диссоциация клеток
- Ферментативное расщепление клеток
- Осторожно аспирируйте HBSS из конической трубки объемом 15 мл, содержащей сегменты среднего мозга, оставив сегменты на дне трубки.
- Добавьте в пробирку ~800 мкл раствора папаина и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 7 мин. Повторно суспендируйте клетки, перевернув пробирку, и замените инкубатором при температуре 37 °C еще на 7 мин.
- С помощью наконечника пипетки с широким отверстием объемом 1 мл удалите только сегменты среднего мозга в аликвоту ДНКазы объемом 1 мл. Дайте сегментам достичь нижней части аликвоты или около 1 минуты воздействия.
- С помощью наконечника пипетки с широким отверстием объемом 1 мл удалите только сегменты среднего мозга в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 2 мл стоп-раствора. Дайте сегментам осесть на дне трубки и повторите полоскание в дополнительной конической трубке, заполненной стоп-раствором.
- Механическое растирание клеточной суспензии
- Во время второй остановки промывки раствором промывки трубки с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл с широким отверстием 1 мл пипетируйте клетки вверх и вниз 10 раз, пока не останутся видны большие сегменты ткани. Важно избегать чрезмерного титрования для минимального лизиса клеток.
- Медленно нанесите пипеткой 300 мкл 4% раствора БСА на дно конической трубки объемом 15 мл, содержащей сегменты мозга. Осторожно снимите наконечник пипетки, чтобы сохранить слой суспензии. Центрифугируйте при 0,4 х г в течение 3 мин. Затем осторожно аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 400 мкл среды для культивирования клеток.
5. Покрытие ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на опыте, на эмбрион собирается около 100 000 жизнеспособных клеток. 2-3-месячные беременные мыши обычно имеют помет 8-10 эмбрионов; следовательно, приблизительная оценка общего выхода клеток на одну беременную мышь составляет примерно 1 миллион клеток.
- Используя гемоцитометр, проведите подсчет клеток, а затем разбавьте суспензию до 2000 клеток/мкл с использованием среды для культивирования клеток. Коротко растирать для перемешивания.
- Удалите покровные стекла с раствором ламинина с шага 2 из инкубатора и отсасывайте оставшийся раствор ламинина из покрытых покровных стекол с помощью вакуума. Быстро накладывайте на пластины, чтобы предотвратить полное высыхание покровных стекол. Нанесите пипетку объемом 100 μл (2,0 x 105 ячеек/покровное стекло) на каждую защитную крышку и поместите чашки Петри в инкубатор при температуре 37 °C на 1 час.
- Осторожно добавьте 3 мл среды для клеточных культур в каждую чашку и поместите ее обратно в инкубатор при температуре 37 °C. Выполняйте полусредние подмены два раза в неделю в течение 2 недель.
6. Инфицирование клеточной культуры на 14 DIV аденоассоциированными вирусными (AAV) векторами
- Для каждого блюда приготовьте 1 мл бессывороточной среды DMEM с 1 мкл hSyn-GCaMP6f AAV (титр 1,0 x10 13)
- Отсадите питательную среду из каждой чашки и замените ее 1 мл бессывороточного DMEM, содержащего hSyn-GCaMP6f. Затем поместите посуду обратно в инкубатор с температурой 37 °C на 1 час.
- Аспирируйте бессывороточную среду, содержащую AAV, и замените ее 3 мл среды для клеточных культур. Поместите посуду обратно в инкубатор с температурой 37 °C. Мы обнаружили, что 5-7 дней после инфицирования AAV позволяют достичь идеального уровня экспрессии GCaMP. На протяжении всего этого периода вирусной инфекции продолжайте менять среду каждые 2-3 дня.
7. Конфокальная визуализация Ca2+ в реальном времени между 19-21 DIV
- Подготовка записывающих буферов
- Чтобы приготовить 1 л записывающего буфера HEPES, добавьте 9,009 г NaCl, 0,3728 г KCl, 0,901 г D-глюкозы, 2,381 г HEPES, 2 мл 1 М CaCl2 стокового раствора и 500 мкл 1 М MgCl2 стокового раствора к 800 мл стерильного дистиллированного H2O. Доведите pH до 7,4 с помощью NaOH. Доведите до конечного объема 1 л.
- Чтобы получить 200 мл 20 мкМ записывающего буфера глутамата, разбавьте 40 мкл 100 мМ стокового раствора глутамата в 200 мл записывающего буфера HEPES, описанного выше.
- Чтобы получить 200 мл 10 мкМ записывающего буфера NBQX, разбавьте 200 мкл 10 мкМ стокового раствора NBQX в 200 мл записывающего буфера HEPES.
- Конфокальная визуализация
- Наполните стерильную чашку Петри диаметром 35 мм 3 мл записывающего буфера.
- Извлеките чашку Петри диаметром 35 мм с зараженными культурами из инкубатора при температуре 37 °C. С помощью щипцов с тонким наконечником осторожно возьмитесь за край одного покровного стекла и быстро перенесите его в чашку Петри, заполненную записывающим буфером. Поместите оставшуюся защитную крышку в среду обратно в инкубатор при температуре 37 °C. Транспортируйте чашку с записывающим буфером к конфокальному микроскопу.
- Запустите программное обеспечение для работы с изображениями. Перейдите к следующему шагу, пока он инициализируется.
- Запустите перистальтическую накачку и поместите линию в буфер записи. Откалибруйте скорость потока со скоростью 2 мл/мин.
- Перенесите зараженный покровный стекло из чашки Петри диаметром 35 мм в ванну для записи.
- Используя 10-кратный объектив для погружения в воду и свет BF, найдите плоскость фокусировки и найдите область с высокой плотностью тел нейронных клеток. Переключитесь на объектив с 40-кратным погружением в воду и с помощью BF-света перефокусируйте образец.
- В окне «Список красителей» в FluoView выберите AlexaFluor 488 и примените его.
- Экспрессия AAV может быть вариабельной, поэтому, чтобы предотвратить передержку и фотообесцвечивание флуорофоров, начните с низких значений HV и мощности лазера. Для канала AlexaFluor 488 установите высокое напряжение (HV) на 500, усиление на 1x и смещение на 0. Для лазерной линейки 488 установите мощность на 5%. Чтобы увеличить эффективный объем, отображаемый в z-плоскости, увеличьте размер точечного отверстия до 300 мкм. Используйте опцию сканирования "focus x2" для оптимальной настройки сигналов излучения до уровней субнасыщения. Отсюда можно регулировать настройки до тех пор, пока не будет достигнута идеальная видимость каждого канала.
заметка: Чтобы точно захватить весь диапазон потоков Ca2+ с помощью GCaMP, отрегулируйте базовые настройки HV и мощности лазера, чтобы обеспечить увеличение интенсивности флуоресценции без перенасыщения детектора.
- После того, как настройки микроскопа оптимизированы, переместите предметный столик, чтобы найти область с несколькими клетками, демонстрирующими спонтанные изменения флуоресценции GCaMP6f, и сфокусируйтесь на нужной плоскости для визуализации.
- Используйте инструмент «Вырезать прямоугольник», чтобы обрезать кадр изображения до размера, позволяющего достичь интервала кадров чуть менее 1 секунды. Это необходимо для установки интервала изображения в 1 кадр в секунду.
- Установите окно "Интервал" на значение 1.0, а окно "Число" на 600.
заметка: Чтобы доставить различные записывающие буферы в желаемый момент времени (300 с), важно откалибровать задержку насоса для подачи нового раствора в ванну. Это будет зависеть от скорости перфузии раствора (2 мл/мин) и длины линии, используемой для перекачивания раствора.
- Чтобы снять фильм серии t, выберите параметр «Время», а затем используйте параметр сканирования «XYt», чтобы начать съемку.
- Следите за индикатором выполнения визуализации и переместите линию из записывающего буфера HEPES в записывающий буфер глутамата 20 мкМ в соответствующий момент времени (например, если задержка насоса откалибрована для подачи раствора через 60 с, переместите линию в буфер глутамата через 240 кадров, чтобы доставить глутамат через 300 с).
- Когда съемка будет завершена, нажмите кнопку «Готово серия» и сохраните готовый видеоролик серии t. Продолжайте перфузировать 20 мкМ глутамата в течение еще 5 минут, чтобы культивируемые нейроны подвергались воздействию глутамата в общей сложности 10 минут. Повторите этот процесс для каждого покровного листа, который будет изображен.
- После дополнительного 5-минутного воздействия глутамата 20 мкМ снимите покровную крышку с ванны и поместите ее обратно в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую записывающий буфер, до тех пор, пока не будет завершен день визуализации.