Приготовление срезов коры рида и гиппокампа из мозга щенка крысы

Аннотация

Источник: Valente, C. A., et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2021)

Видео демонстрирует метод получения срезов ринальной коры-гиппокампа из мозга детеныша крысы и их культивирования в мембранных вставках в многолуночной пластине, заполненной средой, для дальнейшего анализа.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Приготовление срезов коры ринального головного мозга-гиппокампа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления срезов коры рида и гиппокампа используются крысы P6-7 Спрага-Доули.

1. Завязка культуры и подготовка среды
   1. За день до посева подготовьте необходимые среды и поместите их при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте среду для вскрытия: 25 мМ глюкозы в сбалансированном растворе соли Гея (GBSS).
   3. Приготовьте питательную среду: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% лошадиная сыворотка (HS), 25 мМ глюкозы, 30 мкг/мл гентамицина.
   4. Приготовьте поддерживающую среду: Нейробазал-А (НБА), 2% В27, 1 мМ L-глутамина, 30 мкг/мл гентамицина, HS (15%, 10%, 5% и 0%).
2. Сбор мозгов
   1. Непосредственно перед началом культивирования добавьте по 1,1 мл питательной среды в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью пипетки P1000 и поместите его при температуре 37 °C.
   2. Поместите все оборудование (микроскоп для вскрытия, измельчитель тканей, лампу для препарирования, инструменты для препарирования, электроды, планшеты, вкладыши и фильтровальную бумагу) внутрь шкафа биологической безопасности и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
   3. Отрегулируйте толщину среза до 350 мкм.
   4. Достаньте ГБСС из холодильника. Добавьте 5 мл GBSS в шесть чашек Петри. На одно животное потребуется шесть чашек Петри.
   5. Усыпьте детеныша крысы. Выполните обезглавливание с помощью острых ножниц у основания ствола мозга животного.
   6. Трижды вымойте голову животного в холодном ГБСС и занесите внутрь защитного шкафа.
3. Выделение тканей и подготовка ломтиков
   1. Плотно вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удерживать голову.
   2. С помощью тонких ножниц разрежьте кожу головы по средней линии, начиная от позвоночного отверстия по направлению к лобным долям, и отложите его в сторону.
   3. Разрезают так же, как и череп и вдоль поперечной щели головного мозга (пространство между мозгом и мозжечком). Изогнутыми длинными щипцами раздвиньте его.
   4. Выбросьте обонятельные луковицы с помощью шпателя. Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх (рисунок 1А).
   5. Введите тонкие щипцы в мозжечок и двигайтесь по средней линии, очень осторожно открывая каждое полушарие шпателем (рисунок 1B).
   6. С помощью щипцов с коротким изгибом аккуратно удалите лишнюю ткань, покрывающую гиппокамп, не задевая структуру гиппокампа. Затем шпателем разрежьте ниже каждого гиппокампа (рисунок 1В).
   7. Возьмите одно полушарие и положите его гиппокампом вверх на фильтровальную бумагу. Повторите процедуру с другим полушарием и поместите его параллельно первому, в фильтровальную бумагу. Положите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей полусферами перпендикулярно лезвию и разрежьте полусферы на ломтики размером 350 мкм (рис. 1D).
   8. Поместите нарезанную ткань в чашку Петри с холодным GBSS (рисунок 1E).
   9. Аккуратно отделите срезы с помощью электродов с круглым концом (рис. 1F). Оставьте только срезы со структурно неповрежденной корой ринального головного мозга и гиппокампом. Области ДГ и СА должны быть идеально определены, а также энторинальная и периринальная кора (рисунок 1G).
   10. Поместите каждый срез на вкладыш (рис. 1H-I) с помощью шпателя и электрода с круглым наконечником. Удалите излишки диссекционной среды вокруг каждого среза с помощью пипетки P20 (Рисунок 1J). Четыре среза коры головного мозга и гиппокампа могут быть культивированы в одной вставке (рис. 1K).
4. Уход за культурой
   1. Меняйте носитель через день.
   2. Прогрейте среду до 37 °C.
   3. Достаньте тарелки из инкубатора. Возьмите каждую вставку, удерживая пластиковый край щипцами (рис. 1L).
   4. Свободной рукой отсасывайте среду из лунки. Поместите вкладыш обратно в лунку и добавьте 1 мл с помощью пипетки P1000 свежей подогретой среды (рисунок 1M). Повторите для всех вставок. Убедитесь, что между мембраной и средой не застревают пузырьки воздуха.

Результаты

Рисунок 1: Подробная процедура приготовления органотипических срезов коры головного мозга и гиппокампа. (А) Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх. (В) Введите щипцы в мозжечок. Откройте мозг по средней линии и удалите лишнюю ткань над гиппокампом. (В) Шпателем разрежьте ниже гиппокампа, как указано стрелка...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лезвия для рукоятки скальпеля	Инструменты для точной науки	10011-00
Система камер для среза мозга и тканей	Уорнер Инструментс
Вкладыши для клеточных культур, 30 мм, гидрофильный ПТФЭ	Миллипор САС	PICM03050
Обычный инкубатор	Компания Thermo Scientific Heraeus	BB15, Функциональная линия	Установите на 37 °C и 5% CO2
D(+)-Моногидрат глюкозы	Мерк Миллипор	1.08342.1000
D-(+)-раствор глюкозы, 45% в воде	сигма	Г8769
дигидрат гидрофосфата натрия	Merck Milipore	1.06580.1000
Dumont #5 Тонкие щипцы Biologie Inox	Инструменты для точной науки	11254-20
Dumont #5 Щипцы стандартные из нержавеющей стали	Инструменты для точной науки	11251-20
Dumont #7 Щипцы стандартные Dumoxel	Инструменты для точной науки	11271-30
Dumont Medical #7S щипцы с короткой кривой из нержавеющей стали	Инструменты для точной науки	11273-22
Исходный раствор гентамицина, 50 мг/мл	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Сбалансированный солевой раствор Гея (GBSS)	Биологическая промышленность	01-919-1А
Стеклянные электроды	Научная продукция	ГБ150Ф-10	Круглые кончики самодельные
Стеклянные пастеровские пипетки, 230 мм	VWR Интернэшнл	612-1702
Лошадиная сыворотка, инактивированная при нагревании (HS)	Thermo Fisher Scientific	26050-088
Ирисовый шпатель изогнутый	Инструменты для точной науки	10092-12
Шкаф биологической безопасности Labculture класса II	HERASafe	ТН ВЭД 12
L-раствор глютамина 200 мМ (Q)	Thermo Fisher Scientific	25030-024 (Английский)
Нейробазал-А среда (НБА)	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Opti-MEM® I Средство для пониженной сыворотки	Thermo Fisher Scientific	31985-047 (Английский)
Лезвия из платины 5	Джиллетт
Качественная фильтровальная бумага, целлюлоза, Grade 1, 55 мм	ватман	1001-055	Среднее удержание 11μм
Качественная фильтровальная бумага, целлюлоза, Grade 1, 90 мм	ватман	1001-090	Среднее удержание 11μм
Рукоятка скальпеля	Инструменты для точной науки	91003-12
Стерильные 6-луночные планшеты, обработанные TC	Корнинг	CORN3516
Регулятор температуры	КОРПОРАЦИЯ «МЕДИКАЛ СИСТЕМС»	ТК-102
Измельчитель тканей	Микл Лаборатория Инжиниринг CO. LTD.	ВТС/2	Установите значение 350 μм

гг. гг.