Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение, культивирование и стимуляция NK-клеток
- Генерация нейронов ноцицептора в неповрежденном состоянии (контроль однопометника; TRPV1wt::D TAfl/wt) и абляционных (TRPV1cre::D TAfl/wt) мышей путем скрещивания мышей с дифтерийным токсином lox-stop-lox-diphtheria (DTAfl/fl) с мышами TRPV1cre/wt.
- Используя ингаляцию CO2, усыпьте наивную контрольную мышь (TRPV1wt::D TAfl/wt).
- Соберите селезенку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Гомогенизируйте селезенку с помощью пестика.
- Разбавьте клетки 1 мл стерильного PBS.
- Отфильтруйте смесь через клеточное сетчатое фильтр 50 μм в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Долейте объем (10 мл) стерильным PBS.
- Соберите 10 мкл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте клетки (500 × г, 5 мин) и удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клетки в концентрации10-8 клеток/мл в дополненной среде RPMI 1640.
- Следуйте инструкциям производителя для магнитной очистки клеток селезенки Natural Killer (NK) с помощью набора для выделения NK-клеток мыши. Подтвердите чистоту NK-клеток с помощью проточной цитометрии.
- Соберите 10 мкл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте клетки (500 × г, 5 мин) и удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте NK-клетки в дополненной питательной среде RPMI 1640 (содержащей IL-2 и IL-15).
- Культура 2 × 106 NK-клеток/мл в 96-луночном U-образном планшете в течение 48 ч.
2. Выделение и культура нейронов DRG
- За 24 ч до окончания стимуляции NK-клеток (стадия 1.15) покройте 96-луночный планшет 100 мкл/лунка ламинина (1 нг/мл) и инкубируйте в течение 45 мин (37 °C).
- После инкубации извлеките раствор и дайте лункам высохнуть на воздухе в шкафу биобезопасности.
- Используя ингаляцию CO2, усыпьте нейрон ноцицептора в целости и сохранности (контроль однопометника; TRPV1wt::D TAfl/wt) или абляционные (TRPV1cre::D TAfl/wt) мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингаляция CO2 предпочтительнее шейного вывиха, так как она позволяет избежать нарушения спинномозговых нервов, соединенных с DRG (ганглием дорсального корешка).
- Закрепите мышь на доске в положении лежа, приподнимите кожу и надрежьте кожу вдоль спинного столба.
- Отрежьте пояснично-крестцовый сустав и ножницами отделите крестец от поясничного отдела позвоночника.
- Отделите позвоночник, разрезав мышцы и ребра с обеих сторон позвоночника в краниальном направлении, пока не будет достигнуто основание черепа.
- С помощью ножниц отрежьте позвоночник в атланто-затылочном суставе.
- Удалите мышечную и жировую ткань из позвоночника.
- Закрепите и откройте позвоночный столб, чтобы удалить спинной мозг и получить доступ к DRG. Ищите DRG в межпозвоночных отверстиях, соединенных со спинным мозгом через дорсальный корешок, но отделенных от мозговых оболочек.
- Соберите DRG в коническую пробирку объемом 15 мл, заполненную 10 мл ДМЭМ, добавленного ледяным холодом.
- Центрифугируйте препарат (200 × г, 5 мин, комнатной температуры) и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 250 мкл PBS, содержащего коллагеназу IV (1 мг/мл) и диспазу II (2,4 ед/мл).
- Инкубировать DRG с раствором Collagenase IV/Dispase II (C/D) (80 мин, 37 °C, слабое перемешивание). При объединении ганглиев от нескольких мышей поддерживайте соотношение 125 мкл раствора C/D на ганглий.
- Чтобы инактивировать ферменты, добавьте 5 мл добавленной среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
- Раствор центрифугировать (200 × г, 5 мин) и аккуратно удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Чтобы избежать нежелательной потери клеток, оставьте ~100 мкл надосадочной жидкости.
- Добавьте 1 мл дополненной среды DMEM.
- С помощью пистолета-дозатора и трех стеклянных пипеток Пастера уменьшающихся размеров осторожно растирайте (~10 вверх/вниз на размер пипетки Пастера) DRG в одноклеточный препарат.
- В шкафу биобезопасности разведите бычий сывороточный альбумин (БСА) в стерильном PBS (фосфатно-солевом буфере) до конечной концентрации 15%. Храните 1 мл аликвот при температуре −20 °C.
- Создайте градиент BSA в конической пробирке объемом 15 мл, добавив 2 мл стерильного PBS и медленно дозируя 1 мл 15% раствора BSA на дно пробирки. Чтобы не нарушить градиент, аккуратно вытащите пипетку.
- С помощью пипетки P200 медленно нанесите растиращенную суспензию ганглиев (которая содержит нейроны) на сторону трубки в градиент.
- Центрифугирование нейросодержащего градиента БСА (200 × г, 12 мин, комнатная температура). Установите ускорение и замедление центрифуги на минимальную скорость.
Примечание: После центрифугирования нейроны будут находиться на дне пробирки, в то время как клеточный мусор будет захвачен градиентом BSA.
- Аккуратно удалите всю надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Ресуспендируйте клетки в 500 мкл нейробазала.
- Пластина 104 нейрона на лунку (200 мкл нейробазала/лунки) в покрытой ламинином 96-луночной пластине с плоским дном.
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, исследователь сможет заполнить ~8 скважин на одну мышь.
- Культивируйте нейроны (37 °C, на ночь), чтобы обеспечить прикрепление.
3. Сокультура
- Медленно удаляйте нейробазал из культуры нейронов.
- После 48 ч стимуляции IL-2 и IL-15 (см. шаги 1.14-1.15) ресуспендировать NK-клетки и добавить 105-луночных NK-клеток/лунку в культуру нейронов (96-луночная плоская нижняя пластина).
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, исследователь сможет заполнить ~6 скважин на одну мышь.
- Совместное культивирование клеток в добавке нейробазального МХ (37 °C, 48 ч).
