Выделение и культивирование дофаминовых нейронов среднего мозга первичной эмбриональной мыши

Аннотация

Источник: Er, S., et al. Изучение индуцированного предварительно сформированным фибриллом накопления α-синуклеина в первичных дофаминовых нейронах среднего мозга эмбриональной мыши. J. Vis. Exp. (2020).

Видео демонстрирует процесс выделения и культивирования дофаминовых нейронов из среднего мозга эмбрионов мышей. Изолированные вентральные дны среднего мозга диссоциируются с помощью ферментов. Полученные дофаминовые нейроны собирают и переносят в микроостровки внутри многолуночных планшетов. Клетки инкубируются со средой дофаминовых нейронов для поддержания высокой плотности клеток внутри микроостровков.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Подготовка

1. Приготовьте дофаминовую нейронную среду (DPM) с 0,46% D-глюкозы, 1% L-глутамина, 1% N2, 0,2% примоцина, дополненную модифицированной смесью Eagle Medium/питательных веществ F-12 от Dulbecco (DMEM/F12). Отфильтруйте DPM после смешивания ингредиентов. Храните DPM при температуре 4 °C и прогревайте каждую аликвоту только один раз.
   заметка: ДПМ не должен содержать фактор роста, полученный из глиальных клеточных линий (GDNF), так как он снижает накопление α-синуклеина в дофаминовых нейронах.
2. Приготовьте пипетки из силиконизированного стекла, которые обладают чрезвычайно гидрофобными свойствами, тем самым сводя к минимуму прикрепление к поверхности и потерю клеток во время первоначальной обработки эмбриональных нейронов.
   1. Добавьте 10 мл силиконизирующей жидкости в 1 л дистиллированной воды и перемешайте, перемешивая в сосуде объемом 2 л. Оставьте стеклянные пипетки погруженными в силиконизирующий раствор на 15 минут.
   2. Промойте пипетки 3–5 раз дистиллированной водой. Просушите пипетки в течение ночи при комнатной температуре (RT) или в течение 1–2 часов при 100–120 °C в стерильном помещении с подогревом, чтобы ускорить сушку.
   3. Стерилизуйте пипетки стандартным автоклавированием в герметичном автоклавном пакете.
3. Приготовьте покрытые поли-L-орнитином (PO) 96-луночные планшеты с прозрачным дном, добавив 60 мкл раствора PO в средние лунки 96-луночной пластины, которые будут использоваться для заема нейронов, оставив по крайней мере один ряд/столбец лунок по краям пластины во избежание краевых эффектов. Держите пластину с покрытием на ночь при температуре 4 °C или 4 часа при RT.
4. Перед нанесением покрытия на клетки полностью аспирируйте PO и трижды промойте клетки 100 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Отсадите 1x PBS из лунок и держите крышку пластины открытой для полного высыхания.
   заметка: Есть возможность собирать использованные ПО и фильтровать их для повторного использования. Это можно повторить дважды для одного и того же решения PO.
5. Добавьте 50 μL DPM в предварительно покрытые лунки. Отсадите DPM из лунок пластиковым наконечником объемом 100 мкл и одновременно поцарапайте дно лунки круговыми движениями, чтобы удалить покрытие по периметру каждой лунки. В середине скважины останется остров с покрытием PO.
6. Под ламинарный колпак добавьте 10 μL DPM в середину каждого островка с покрытием, чтобы создать микроостровки.
   заметка: Планшет с микроостровками, покрытыми DPM, можно держать под ламинарным проточным колпаком в течение 1–2 часов во время изоляции клеток

2. Выделение вентрального дна среднего мозга из эмбрионов мыши на эмбриональный день 13,5 (E13,5)

1. Перед вскрытием заполните чашку Петри диаметром 10 см буфером Дульбекко и держите ее на льду.
2. Усыпьте беременную самку мыши E13.5 в соответствии с рекомендациями учреждения. Положите мышь на спину и распылите на переднюю часть тела 70% этанола. Приподнимите кожу над маткой с помощью щипцов и сделайте разрез хирургическими ножницами, чтобы обнажить матку.
3. Аккуратно удалите матку и поместите ее в заранее подготовленную чашку Петри на льду.
4. С помощью хирургических ножниц под ламинарным капюшоном в РТ аккуратно извлеките эмбрионы из матки. Удалите все остатки плаценты из эмбрионов с помощью щипцов и поместите их в новую чашку Петри диаметром 10 см, заполненную буфером Дульбекко.
5. С помощью рассекательных щипцов или игл отрежьте заднюю четверть головы от мест, отмеченных черными стрелками на рисунке 1А. Отрежьте отрезанный кусок от остальной части эмбриона (рисунок 1B).
6. Поместите заднюю часть отрезанного куска к наблюдателю (рисунок 1C) и аккуратно разрежьте его от каудального к краниальному (рисунок 1D). На 0,5 мм ниже отверстия черепа вырежьте область²–3^мм2 диаметром 2 мм, показанную на рисунке 1Е.
7. Соберите вентральное дно среднего мозга (см. рисунок 1F) в пустую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Держите микроцентрифужную трубку на льду до тех пор, пока в ней не соберутся все дны среднего мозга.
   заметка: В качестве альтернативы, дно среднего мозга может быть собрано с помощью микропипетки объемом 1 мл после вскрытия мозга всех эмбрионов.

3. Создание первичных эмбриональных культур среднего мозга из эмбрионов мыши E13.5 в формате 96-луночных планшетов

1. После сбора дна среднего мозга у всех эмбрионов в одной и той же пробирке объемом 1,5 мл удалите остаточный буфер Дульбекко и трижды промойте кусочки ткани 500 мкл Ca2⁺, свободного от Mg2⁺ сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS).
2. Удалите HBSS и добавьте в пробирку 500 мкл 0,5% трипсина. Выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
3. Во время инкубации подогрейте 1,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 °C, добавьте 30 мкл ДНКазы I в FBS и перемешайте. Кроме того, отполируйте огневкой кончик пипетки из силиконизированного стекла. Убедитесь, что отверстие не имеет острых краев и имеет примерно такой же размер, как наконечник для микропипетки объемом 1 мл.
   заметка: В качестве альтернативы для растирания можно использовать наконечник для микропипетки объемом 1 мл с низкой адгезией. Тем не менее, пипетки из силиконизированного стекла, по-видимому, дают наилучшие результаты.
4. Как только инкубация на шаге 3.2 закончится, добавьте 500 мкл смеси FBS/DNase в частично переваренную ткань. Используйте стеклянную пипетку для растирания ткани в смеси FBS/трипсина. Растирайте до тех пор, пока ткани не разделятся на мельчайшие, едва заметные частицы. Избегайте образования пузырей во время растирания.
5. Дайте оставшимся частицам осадиться на дне микроцентрифужной пробирки под действием силы тяжести. Не пипетируя осадок на дне, соберите надосадочную жидкость в пустую коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл.
6. Разбавьте FBS/DNase I на стадии 3.3 (98:2) 1000 мкл HBSS для получения FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Перемешайте пипеткой вверх и вниз. Добавьте 1 000 μл новой смеси к оставшимся частицам в микроцентрифужной пробирке. Снова разомните и повторите шаг 3.5.
7. Повторите предыдущий шаг еще раз, чтобы израсходовать все FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. После того, как вся надосадочная жидкость будет собрана внутри пробирки объемом 15 мл (из этапов 3.5, 3.7 и 3.8), используйте настольную центрифугу для вращения надосадочной жидкости (~3 мл) при 100 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, не касаясь гранулированных клеток на дне.
9. Промойте гранулу ячейки, добавив 2 мл DPM в пробирку, и уменьшите ее до 100 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторите промывку 2 раза, чтобы свести к минимуму загрязнение в гранулированных ячейках><. заметка: Всегда используйте свежий, подогретый DPM для культивируемых нейронов. Для этапов стирки DPM не обязательно должен быть свежим, но должен быть предварительно нагрет до 37 °C.
10. Разбавьте клетки свежим, теплым DPM и переложите их в микроцентрифужную пробирку. Количество ДПМ для разведения зависит от количества эмбрионов, используемых для рассечения тканей. Например, используйте 150 мкл DPM для разбавления клеток, полученных из десяти эмбрионов.
11. Перенесите 10 мкл клеток в DPM в микроцентрифужную пробирку. Смешайте их с 10 мкл 0,4% трипанового синего морилки. Подсчет живых (т.е. трипановых синих отрицательных) клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    заметка: Используйте 30 000 клеток для покрытия каждой лунки, чтобы получить ~1 000 дофаминовых нейронов на лунку. Если плотность клеток превышает ~30 000 клеток на 6 мкл, дополнительно разбавьте клетки DPM перед нанесением покрытия так, чтобы объем посева составлял не менее 6 мкл.
12. Не касаясь дна лунок, извлеките DPM из микроостровков, созданных на шаге 1.6.
13. Чтобы получить воспроизводимую плотность клеток в каждой лунке, смешайте клетки с помощью щадящего пипетирования перед нанесением покрытия в лунку. С помощью микропипетки объемом 1–10 мкл добавьте 6 мкл клеток в середину лунки, в месте расположения каждого бывшего микроостровка.
14. Заполните пустые лунки по краям пластины 150 μл воды или 1x PBS, чтобы свести к минимуму испарение из лунок, содержащих культуры нейронов. Инкубировать планшет в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%_CO2 в течение 1 ч.
15. Через 1 ч выньте планшет из инкубатора, добавьте по 100 мкл DPM в каждую лунку с ячейками и поместите обратно в инкубатор.
16. Через два дня после нанесения покрытия (день in vitro 2, или DIV2) удалите 25 μL и добавьте 75 μL свежего DPM, чтобы довести окончательный объем среды до 150 μL и максимально избежать испарения.
17. Замените половину среды на свежую DPM (т.е. удалите 75 μL и добавьте 75 μL свежего DPM) при DIV5. Не меняйте носители после DIV5.

Результаты

Рисунок 1: Вскрытие дна среднего мозга из эмбриона мыши E13.5. (А) Места разделки на задней четвертине головы отмечены черными стрелками и белыми пунктирными линиями. (Б) Кусочек был отделен от остальной части эмбриона. Снятый кусок обводится кружком. (C) Деталь была повернута на 90° лицом к наблюдателю. (D) Изделие было раскрыто чер...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,4% Трипановый синий морилка	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	15250061
15 мл CELLSTAR Полипропиленовая туба	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия	188261
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	10236276001
5 м HCl	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
5 М NaOH	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
96-луночная смотровая панель (черная)	PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США	6005182
99,5% этанол (EtOH)	Altia Oyj, Раямяки, Финляндия	Н/Д
АкваСил Силиконизирующая жидкость	Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	ТС-42799
Автоклавная микроцентрифужная пробирка 1,5 мл	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
Ультразвуковой аппарат Bioruptor	Diagenode, Льеж, Бельгия	B01020001
Ca2+, Mg2+ свободный сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	14175-053
Программные пакеты CellProfiler и CellAnalyst	Н/Д	Н/Д	Бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом
Центрифуга 5702	Eppendorf AG, Гамбург, Германия	5702000019
Инкубатор CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	Н/Д
Счетная камера	BioRad Inc., Геркулес, Калифорния, США	1450015
Микроскоп сверхвысокого разрешения DeltaVision с воздушным столом и шкафом	GE Healthcare Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США	29254706
Дезоксирибонуклеаза-I (Днасе I)	Roche, Базель, Швейцария	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	21331–020
Буфер Дульбекко	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	10500056
D-глюкоза	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	Г8769
Фоспохататный буферный физиологический раствор (PBS)	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
Примоцин	InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния, США	АНТ-ПМ-1, АНТ-ПМ-2
поли-L-орнитин	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	П4957
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	11332481001
трипсин	MP Biomedicals, Valiant Co., Яньтай, Шаньдун, Китай	No 2199700 (Английский

)